间接法建立长春地区成人肝功能四项生化指标参考区间

王艺婷， 李雪文， 邢东洋， 何 冰， 许建成

吉林大学第一医院 检验科， 长春 130021

检验项目参考区间是临床疾病诊断与健康监测的主要依据，参考区间的准确性、适用性直接影响着临床判断。2012年，我国卫生行业标准发布了血清AST、ALT、GGT、ALP等项目的参考区间，同时指出该参考区间可能受民族、地区影响而致其不适用，各实验室可自行建立参考区间[1]。目前建立参考区间的方法有直接法[2]和间接法[3]，直接法需通过建立严格的排除标准而筛选符合要求的参考个体，且此法过程漫长繁琐、难以实施；而间接法只需通过数学统计，凭借快速简便、能得到与直接法相似结果的优势脱颖而出。本研究利用临床实验室信息系统(laboratory information system，LIS)已有数据，用数学统计模型建立AST、ALT、GGT、ALP间接法参考区间，并与国家行业标准比较，以期为临床疾病诊断与健康监测提供依据和参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集本院2019年10月—2020年10月LIS中体检中心健康人群数据，排除信息不全及溶血、脂血、黄疸等不合格样本后，通过比对样本号、姓名、年龄、就诊日期等信息确认为同一来源选择首次测量结果。共入组20～79岁健康人群数据29 443例，其中男性13 423例、女性16 020例。

1.2 仪器与试剂 使用日立公司的7600-210全自动生化分析仪、上海科华公司的试剂与标准品、美国伯乐公司的室内质控品。仪器每年由厂家进行一次校准，每日8点前至少对高、中、低值质控品进行测定(批号： 45803， 45802， 45801)。

1.3 研究方法 AST的检测方法为紫外-苹果酸脱氢酶法，ALT的检测方法为紫外-乳酸脱氢酶法，GGT的检测方法为L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯氨法，ALP的检测方法为AMP缓冲液法。研究对象空腹8 h后于次日上午7∶30—9∶30安坐，自肘前静脉真空采血4 ml，常温送至检验科进行上述4种生化指标检测。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由吉林大学第一医院伦理委员会批准，批号： 2019-249。

1.5 统计学方法 利用SPSS 23.0、Minitab 17、LMS chartmaker Light 2.54、Excel 2016软件分析数据。柯尔莫哥洛夫-斯米诺夫检验判断数据正态性，若其呈偏态分布则使用BOC-COX法转换，此法中的待定变换参数λ由极大似然法求得，其值由所有数据决定。BOX-COX法可针对不同的λ做出不同变换。转换后的数据经P-P图检验为近似正态分布后，使用Turkey法剔除离群值。剔除时把四项指标视为一个整体，若其中任意一个指标符合剔除标准则剔除此人全部信息。Spearman相关分析判断AST、ALT、GGT、ALP与年龄的相关性。LMS法建立连续百分位数曲线。Mann-WhitneyU检验比较性别差异，5岁为一年龄组，Z检验比较年龄差异。用数据均值、标准方差及样本量计算Z与Z*值，如Z>Z*则差异有统计学意义，需分组建立参考区间[2]。非参数法计算数据分布的2.5%和97.5%百分位值作为参考区间的上、下限，并用Bootstrap计算其90%置信区间。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据分布与离群值剔除 调取的AST、ALT、GGT、ALP数据均不服从正态分布，使用BOX-COX法将其转换为近似正态分布，其中四组数据的待定变换参数λ分别为-0.80、-0.78、0.25、-0.10。使用Turkey法剔除数据2225例，其中男性1213例，女性1012例。正态转换及离群值剔除前后具体数据详见表1。

表1 BOX-COX变换及剔除前后数据分布

2.2 AST、ALT、GGT、ALP水平的性别及年龄间比较 Mann-WhitneyU检验结果显示，AST在20～54岁性别间差异有统计学意义(7个年龄段Z值分别为-5.68、-15.59、-30.14、-25.86、-19.22、-15.12、-4.29，P值均<0.05)。ALT、GGT、ALP在各年龄组不同性别间差异均有统计学意义(ALT各年龄段Z值分别为-10.27、-24.71、-39.41、-33.86、-28.14、-26.94、-15.17、-11.52、-5.90、-4.77、-3.20、-3.83；GGT各年龄段Z值分别为-12.06、-24.95、-39.70、-34.04、-31.95、-31.61、-23.33、-19.20、-13.54、-9.46、-6.29、-3.65；ALP各年龄段Z值分别为-8.32、-16.36、-22.67、-23.55、-20.42、-14.99、-4.62、-12.77、-10.20、-8.54、-5.03、-2.59，P值均<0.05)。Spearman相关结果显示，男性ALT(r=-0.191，P<0.001)、GGT(r=-0.041，P<0.001)与年龄呈负相关；女性AST(r=0.365，P<0.001)、ALT(r=0.310，P<0.001)、GGT(r=0.264，P<0.001)及ALP(r=0.411，P<0.001)与年龄呈正相关。分组后各亚组样本量均大于120例。男性ALT、GGT及女性AST、ALT、GGT、ALP的年龄差异均有统计学意义(Z>Z*)。AST、ALT、GGT、ALP水平连续百分位数曲线见图1。

图1 AST、ALT、GGT、ALP水平连续百分位数曲线

2.3 参考区间的建立、验证及比较 用于验证的样本剔除离群值后共10 598例，其中男性6292例、女性4306例。

男性、女性共14个亚组，各组验证样本量均>20例，4项生化指标均有>90%的测定值落在本研究参考区间内。使用非参数方法计算的AST、ALT、GGT、ALP参考区间及适用性验证见表2。为与我国行业标准保持一致，本研究结果取整数。AST、ALT、GGT和女性20～49岁ALP参考区间与我国行业标准的相对偏差均低于RCV，男性及50～79岁女性ALP参考区间与我国行业标准的相对偏差高于RCV。本研究结果与国内外研究结果比较见表3。

表2 AST、ALT、GGT、ALP参考区间及适用性验证

3 讨论

血清AST、ALT、GGT、ALP作为常规肝功能检测的四项指标对肝肾疾病的诊断及治疗至关重要。近年有研究表明，AST、ALT与癌细胞代谢密切相关，并与不同类型癌症的预后有关[5]；ALT与非酒精性脂肪肝性肝炎的肝脏炎症、肝纤维化及肝脂肪变性程度显著相关[6]。也有研究[7]结果显示，GGT、ALP与肾脏预后独立相关。故建立其准确可靠的参考区间具有重要意义。

本研究中男性随年龄增加，ALT、GGT水平先上升后下降，验证了我国多中心研究[8]中男性ALT、GGT水平在40岁前随年龄升高，在40岁后保持不变或下降的结论。这种趋势的可能原因是，ALT、GGT水平与酒精有关[9]，人进入中老年期，中度或重度饮酒人士数量减少。本研究中女性AST、ALT、GGT、ALP水平均随年龄增加，在45～55岁时上升明显，验证了我国多中心研究[8]中女性AST、ALT、GGT、ALP与年龄正相关、我国北京[10]ALP水平在50岁后升高的结论。女性45～55岁呈现出的特殊性可能与其生理变化有关，大多数女性在该年龄段步入更年期、绝经期，性激素波动明显。本研究中男性或女性ALT水平在60岁后均有不同程度下降，验证了美国老年人ALT水平与年龄呈负相关的研究结果[11]，提示临床医生在解释患者(尤其是老年人)ALT水平时应考虑年龄因素。

通过相对偏差与RCV比较，本研究自建的男性ALP参考区间上限、女性50～79岁ALP参考区间上、下限与我国行业标准间差异有统计学意义(相对偏差>RCV)。男性GGT参考区间下限与我国上海的研究[12]、女性AST、GGT、ALP参考区间上限与沙特阿拉伯的研究[13]、男性ALP参考区间上、下限及50～79岁女性ALP参考区间上限与俄罗斯的研究[14]差异有统计学意义(相对偏差>RCV)。造成差异的原因可能是：(1)这4项生化指标与BMI有关[14-15]，或与人群、种族、遗传、地域、生活习惯、饮食结构等有关；(2)样本量不足，纳入研究的数据不足以代替整个人群；(3)不同实验室建立参考区间的检测方法、试剂、仪器等差异；(4)可能存在异常数据，虽经过离群值剔除但不能确保纳入研究的个体为完全健康没有疾病。自建的ALP参考区间与我国行业标准间的差异可通过增加样本量来改善。另外本研究建立的参考区间通过适用性验证，表明该参考区间适用于本地区人群，证实间接法建立参考区间的可行性。此前本实验室已使用直接法建立了长春地区儿童血清AST、ALT、GGT、ALP参考区间[16-17]。直接法虽是建立参考区间的标准方法，但其过程漫长繁琐，如需面对特殊群体(新生儿、孕妇、老人等)会使数据更加难以收集。若实验室直接引用试剂厂商提供的参考区间，难免存在种族、环境等差异。而间接法利用已有数据既可获得特殊群体足够多的数据量，又无需额外投入，是一种很好的选择，适合不同实验室根据本地区人群、检测系统等实际情况建立参考区间。本研究以LIS数据为基础，运用数学统计模型建立参考区间，虽可能纳入异常数据，但通过适宜数据转换、离群值剔除后计算参考区间可有效弥补这一缺陷[8]。间接法作为一种回顾性研究，其实施过程无法达到与直接法一致的严谨程度，各界对其存在一定争议，故应定期验证间接法建立的参考区间以确保其可靠性。本研究根据数据分布及样本量选择了BOX-COX法、Turkey法与非参数法，目前尚不能评价本研究所用方法的优劣。尽管如此，间接法仍然凭借着简单快速的优势在未来有很好的应用前景。

血清酶与性别、年龄等因素关系密切，故应根据性别及年龄建立参考区间。本研究使用间接法建立了成人血清AST、ALT、GGT、ALP的性别及年龄特异性参考区间。该参考区间与我国行业标准较为一致，证实间接法建立参考区间的可信度和可靠性。本研究为血清酶类参考区间研究提供了基础数据，有益于肝病及其他相关疾病的预防及鉴别诊断。

利益冲突声明：本研究不存在研究者之间、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：王艺婷负责课题设计，资料分析，撰写论文；李雪文、邢东洋、何冰参与收集数据，修改论文；许建成负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。