NLRP3炎性体在胆总管结扎诱导的肝纤维化大鼠模型中的表达特点

周蒙恩， 陈懿榕， 张 娜， 晏 旎， 阙任烨， 李 勇

上海中医药大学附属市中医医院 脾胃病科， 上海 200071

肝纤维化是指细胞外基质过多沉积，破坏肝脏的生理结构，是各种慢性肝病(如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等)的共同结果[1]。晚期肝纤维化可能进展为不可逆转的肝硬化，肝硬化可引起腹水、脾肿大、侧支循环形成、上消化道出血，甚至导致死亡[2]。NLRP3炎性体是机体固有免疫系统的重要组成部分，参与多种炎性疾病的发生发展。研究发现，在丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纤维化、肝脏缺血/再灌注损伤等急慢性肝脏疾病发生发展过程中都存在着NLRP3炎性体的活化[3-7]，而在胆管结扎大鼠中尚未报道。本实验通过胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)造成大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型，观察肝纤维化过程中NLRP3炎性体的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD成年大鼠，65只，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证编号：SCXK(沪)2012-0002，实验动物使用许可证编号：SYXK(沪)2020-0014，自由进食饮水，恒温 (25±2)℃，恒湿，12 h/d，明暗交替。

1.2 试剂和仪器 NLRP3抗体(Cell Signaling Technology，美国)，ASC抗体、caspase1抗体(Novus Biologicals, 美国)，β-actin抗体(上海碧云天生物技术有限公司)，IL-1β ELISA 检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific， 美国)，TGFβ1、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)，苏木素-伊红染色液(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，Masson染色液(北京索莱宝科技有限公司)，天狼星红染色液(北京雷根生物技术有限公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。天能EPS300电泳仪(上海天能科技有限公司)，RM2016切片机(莱卡公司)，多功能酶标仪(Thermo, 美国)，Nanodrop2000(Thermo, 美国)，S1000 PCR仪(BIO-RAD，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及模型建立 将65只SD大鼠随机分为假手术组和模型组，假手术组15只，模型组50只，模型组行BDL，假手术组仅开腹并游离胆总管后关腹。造模方法参照文献[8]进行，分别于第3、7、14、21、28天，处死10只模型组，同时处死3只假手术组。动物处死后取血清、肝组织标本备用。肝组织标本保存于-80 ℃中，部分标本用中性福尔马林固定12 h后经石蜡包埋，3～5 μm厚连续切片备检。

1.3.2 肝功能指标 用全自动生化分析仪检测血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil水平。

1.3.3 肝脏病理组织检查 病理组织学采用HE染色、Masson染色、天狼星红-苦味酸染色3种染色方法，取备检石蜡切片经脱蜡、水化、染色、分化、透明、封片、镜检，分别观察病变与纤维化程度。肝纤维化评分标准参照《肝纤维化诊断及治疗共识(2019年)》[9]。

1.3.4 免疫组化检测αSMA及TGFβ1表达 石蜡切片经脱蜡、水化，抗原修复冷却后，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性, 血清封闭，孵育一抗、孵育二抗，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明后封片、镜检，用Image-Pro Plus 6.0 软件对肝组织阳性表达面积进行半定量分析。

1.3.5 Western Blot检测NLRP3炎性体表达

取大鼠肝脏组织裂解后，提蛋白，以SDS-PAGE凝胶(5%浓缩胶，12%分离胶)进行电泳分离胶分离蛋白，并通过半干转法转移至PVDF膜，PVDF膜经5%的脱脂奶粉摇床上慢摇2 h封闭，分别与NLRP3抗体、ASC抗体、caspase1抗体4 ℃过夜，室温孵育二抗2 h，ECL光化学显色。最后应用Image J分析软件对扫描条带进行定量分析，计算各蛋白相对表达量。

1.3.6 RT-PCR检测NLRP3、ASC、caspase1炎性体表达

取大鼠肝脏组织加入Trizol研磨离心取上清，提取总RNA，Nanodrop2000检测RNA的纯度和浓度，各组取2 μl总RNA，按20 μl总反应体积，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板分别进行PCR扩增。NLRP3上游引物 5′- GCTGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下游引物5′- AAGGCTGTCCTCCTGGCATACC-3′；ASC上游引物5′-ACAATGACTGTGCTTAGAGACA-3′，下游引物5′-CACAGCTCCAGACTCTTCTTTA-3′；caspase1上游引物5′-AGAGGATTTCTTAACGGATGCA-3′，下游引物5′-TCACAAGACCAGGCATATTCTT-3′；β-actin上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。采用三步法进行PCR扩增，反应结束后，得到各样本 CT值，然后利用2-△△Ct计算各组基因的相对表达量。

1.3.7 ELISA检测IL-1β水平 取肝组织，置于含RIPA裂解液的离心管中裂解蛋白，4 ℃条件下离心，取上清液。按 ELISA 试剂盒说明书操作步骤检测各组肝组织IL-1β水平。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由上海市中医医院医学伦理委员会审批，批号： SZY2017018，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 BDL大鼠血清肝功能检测 BDL模型组大鼠自BDL术后血清肝功能各检测指标显著提高，并于第3天达最大值(P值均<0.05)；第7～28天各指标较3天组下降，但与假手术组相比仍有升高(P值均<0.05)(表1)。

2.2 大鼠肝脏组织HE染色 假手术组无炎症细胞浸润，肝细胞多，肝小叶结构完整；第3天和第7天BDL组可见汇管区少量炎细胞浸润，肝小叶间胆管增生，中央静脉与肝血窦轻度扩张淤血；第14天起可见汇管区纤维组织增生，肝小叶间胆管明显增生，部分分割包绕肝小叶使其结构紊乱，第28天肝小叶结构严重破坏，被沉积的胶原分割成大量假小叶(图1)。

注：a，假手术组；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.3 大鼠肝脏组织Masson染色 假手术组肝组织、肝小叶结构清晰，肝细胞索呈放射状排列；胆总管结扎3 d后可见少量胶原纤维在汇管区和中央静脉分布；第7天汇管区、肝窦扩大，纤维组织增生，沿汇管区、中央静脉向外延伸；第14天汇管区、肝窦区、中央静脉纤维组织增生，面积较前扩大；第21天大鼠肝组织胶原纤维带明显；第28天可见肝细胞脂肪样变，小叶结构紊乱，纤维条索更加粗大明显，部分互相连接(图2)。

注：a，假手术组；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.4 大鼠肝脏组织苦味酸-天狼星染色 假手术组在中央静脉壁和汇管区间见极少量胶原纤维，胆总管结扎3d后汇管区可见胶原纤维增生沉积较假手术组增多，随着胆管结扎时间逐渐延长，肝纤维化程度持续增加，肝内胶原沉积在增生的胆管上皮细胞周围，以汇管区为中心向肝实质延伸，增生的小胆管及其周围的胶原纤维形成间隔，部分与临近的增生间隔相互连接、包绕、分割，形成假小叶(图3)。

注：a，假手术组；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.5 免疫组化检测αSMA及TGFβ1在大鼠肝组织中的表达 结果显示，假手术组仅在血管壁平滑肌见少量αSMA表达；BDL第3天，αSMA在血管壁表达明显；第7天汇管区的胆管壁亦见αSMA表达、棕黄色颜色加深；第14天αSMA表达较前明显增多，呈长椭圆形；第21、28天在汇管区、纤维间隔区αSMA蛋白沉积明显、αSMA阳性表达的面积增大，染色明显加深(图4)。假手术组大鼠肝组织中可见少量TGFβ1表达，主要在肝组织的间质细胞；BDL第3、7天，大鼠肝组织中汇管区TGFβ1表达，呈棕黄色胞浆型分布；第14天，TGFβ1表达明显增强，数目增多，汇管区和纤维隔中染色明显加深，呈斑片状弥漫性分部(图5)。

注：a，假手术组；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

注：a，假手术组；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.6 免疫组化半定量及肝纤维化程度评分 结果提示，免疫组化半定量中，除BDL第3天外，各组与假手术组相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，且随时间延长αSMA、TGFβ1表达强度增加；肝纤维化评分比较，各组与假手术组相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，且随时间延长肝纤维化程度增加(表2)。

表2 免疫组化半定量及肝纤维化评分

2.7 NLRP3炎性体蛋白表达 与假手术组比较，除BDL3 d组NLRP3外，余组NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、caspase1)蛋白表达均增加(P值均<0.05)，随时间延长，BDL14 d前组间比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，第14天后增高趋于平稳(图6，表3)。

表3 NLRP3炎性体蛋白表达

图6 大鼠肝组织NLRP3炎性体蛋白表达情况

2.8 NLRP3炎性体mRNA表达 与假手术组比较，各组NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、caspase1)mRNA表达均增加(P值均<0.05)，随时间延长，BDL14 d前组间比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，14天后增高趋于平稳(表4)。

表4 NLRP3炎性体mRNA表达

2.9 肝组织IL-1β水平 IL-1β在造模后第3天明显增高，并达到最高值，第7～28天各指标较第3天下降，但与假手术组相比仍有升高(P值均<0.05)(表5)。

表5 各组肝组织IL-1β水平

3 讨论

BDL是制作肝纤维化动物模型的经典方法，可导致肝细胞变性、坏死及肝纤维化，最终导致肝硬化[1,9]。胆总管结扎急性期为3 d，慢性期超过10 d，急性期主要是炎症开始及免疫细胞浸润，慢性期主要是免疫细胞浸润、炎症和晚期纤维化的变化导致疾病进展[10]。肝脏受伤后，肝星状细胞被激活分化为产生胶原的肌成纤维细胞，从而导致细胞外基质的过度产生，是肝纤维化发生发展的重要环节[11-12]。而αSMA的表达是肝星状细胞活化的重要标志[13-14]，TGFβ1是参与肝纤维化过程中影响肝星状细胞活化的最有效介质[15]，它通过刺激细胞外基质的合成和抑制细胞外基质的降解，在将静止的肝星状细胞转化为纤维化的肌成纤维细胞过程中起着至关重要的作用[16]。NLRP3炎性体主要是由NLRP3、ASC、caspase1三者相互作用，形成的一个同心的组织，其中ASC层包围着NLRP3蛋白，而caspase1则附着在外面的ASC层上[17]。NLRP3炎性体是机体固有免疫系统的重要组成部分，能够识别各种应激、外源微生物和内源性危险信号，被多种刺激激活[18-19]。NLRP3炎性体被激活后，产生有活性的caspase1，导致IL-1β和IL-18的释放，介导炎症反应发生[20]。近来有研究[21]表明，NLRP3炎症体在肝星状细胞激活中的作用直接引发了肝纤维化。

有研究[22-25]显示，NLRP3炎性体参与慢性阻塞性肺疾病、糖尿病肾病、心血管疾病、炎性肠病以及自身免疫疾病等的发生发展。同时在各种急慢性肝病及肝纤维化中也存在NLRP3的表达[26]，这将有望成为临床上治疗疾病的新靶点。据报道NLRP3抑制剂MCC-950可以减轻小鼠实验性非酒精性脂肪性肝炎中的肝脏炎症和纤维化[27]，caspase1抑制剂在体内抑制NLRP3炎症小体可显著降低胆管结扎小鼠肝组织成熟IL-1β水平，减轻肝纤维化程度[28]。但并没有实验说明NLRP3炎性体与肝纤维化的相关性，以及在肝纤维化形成过程中NLRP3炎性体是否持续活化。

本研究结果显示，BDL大鼠模型第3天处于急性期，血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil、肝组织IL-1β水平明显升高，其后有所下降，考虑后期由急性期转入慢性，在肝脏的自我修复功能作用下，肝功能指标及IL-1β有所恢复，但仍不能恢复到正常水平，随着时间延长炎症损伤持续存在。HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色，显示BDL大鼠模型组随时间延长，可见炎症细胞浸润，肝小叶间胆管增生，汇管区纤维组织增生，后期大量假小叶形成，以及胶原纤维沉积持续增加，肝纤维化程度评分逐渐增加，提示BDL大鼠模型中存在着肝炎-肝纤维化-肝硬化的动态演变；免疫组化结果显示αSMA、TGFβ1 蛋白随时间延长表达强度逐渐增加，提示肝纤维化过程持续加重；BDL大鼠模型组肝组织中NLRP3炎性体蛋白及mRNA表达渐次增高，14 d后趋于平稳，提示在肝纤维化过程中NLRP3炎性体活化持续存在，考虑到14 d后肝纤维化向肝硬化方向转变，但NLRP3炎性体仍处于高表达状态，说明在肝纤维化-肝硬化过程中NLRP3炎性体亦参与其中，但其作用机制仍需进一步探究。

以上结果显示 BDL大鼠造模后肝脏损伤，病理学胶原纤维明显沉积，肝纤维化标志物明显表达，证实了BDL大鼠模型中存在肝炎-肝纤维化-肝硬化的动态演变；伴随着肝纤维化的发生发展，NLRP3炎性体蛋白及基因表达明显上调，并于BDL14 d后处于稳定高表达状态，提示在肝炎-肝纤维化-肝硬化演变过程中存在着NLRP3炎性体的持续活化，可能与其发挥促进纤维化的作用有关。因此从NLRP3炎性体进行研究，探索肝纤维化的机理，有助于阻断肝纤维化的产生，阻止病情进一步恶化，对临床肝纤维化的治疗及新药的开发提供了一定依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：周蒙恩、陈懿榕等负责课题设计，资料分析，撰写论文；张娜、晏旎、阙任烨等参与收集数据，修改论文；李勇等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。