硫磺菌子实体活性成分对植物病原真菌抑菌的初步研究*

权 琳，刘晓凤，梁 洪，何建清

（1.德阳科贸职业学院，四川 德阳 618000；2.民办四川天一学院，四川 德阳 618000；3.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000）

硫磺菌[Laetiporμs sμlphμreμs（Fr.）Murrill]，别名硫色干酪菌、硫磺多孔菌，是一种药食兼用的高等真菌，广泛分布在西藏、河北、吉林及辽宁等地[1]。陈士瑜等[2]研究表明，硫磺菌子实体被火焚烧后，能够对蚊、螨及蜢等病虫有驱逐作用，有望用于天然驱虫药物开发。据报道，硫磺菌子实体所产生的齿孔酸（eburicoic acid）能合成甾体药物，可以调节机体，增加抵抗力，子实体所产生的麦角甾醇也可以作为重要的医药化工原料[3]；此外，硫磺菌子实体中还含有甜菜碱（betaine）和胡芦巴碱（trigonelline）等生物碱[4]。一些生物碱，如鲸蜡基甜菜碱对生物膜有消除作用且对变形链球菌有抑制作用[5]。甜菜碱可用于杀灭包括结核菌在内的多种细菌，可作为杀菌消毒洗涤剂使用[6]。通过对硫磺菌子实体中抑菌活性进行研究，以期为其进一步开发利用奠定基础。

小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum） 是对小麦生产危害较大的一种真菌性病害，会造成小麦减产10%～20%，严重时达80%～90%[7]，引起小麦籽粒腐败变质，严重危害人畜健康[8]。马铃薯干腐病菌（Fusarium coeruleum） 是一种世界性土传病害，对全球马铃薯产业造成巨大危害，且防治较困难[9]，据报道，马铃薯病害逐年加重，严重影响马铃薯的产量和质量，其中由镰刀菌（Fusarium sp.）引起的干腐病更是制约马铃薯产业稳步发展的头号大敌，常造成6%～25%的减产，严重时减产60%以上[10]。目前，普遍使用的传统化学合成抗菌药大多毒性大，残留高，对环境、动物和人类身体健康均有诸多不良影响，长期使用会破坏生态的多样性以及粮食作物的安全性。随着环保意识的增强和研究技术的发展，人们开始关注从天然资源中获得更安全、更环保及更高效的抗菌剂。药用真菌种类丰富，是产生新结构与具有活性天然小分子化合物的重要生物类群，对其进行深入研究，进而发现更多具有抗感染作用的药用真菌，探索真菌抗菌作用的物质基础，作为生物抗菌剂进行研发和利用，具有重大意义[11]。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

试验所用仪器设备见表1。

表1 仪器设备信息Tab.1 Information of instrument and equipment

1.2 试剂、培养基与材料

供试菌种：硫磺菌子实体，来自西藏农牧学院真菌实验室。

供试病原真菌：小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum） 和马铃薯干腐病菌（Fusarium coeruleum），来自西藏农牧学院真菌实验室。

其他试验试剂见表2。

表2 试剂与材料Tab.2 Reagentsand materials

2 试验方法

2.1 硫磺菌子实体生物碱类化合物提纯制备

精密称定硫磺菌子实体粉末（甜菜碱含量0.79%）5 g，置于250 mL烧杯中，加入蒸馏水100 mL。在水浴锅上加热至100℃，再加入碱性氧化铝25 g搅拌均匀，过滤。取滤液于蒸发皿中，置水浴锅上挥干溶剂。称取碱性氧化铝（100目～200目） 50 g填充柱层析，把蒸干后的化合物填充于碱性氧化铝柱上层，然后用95%乙醇500 mL洗脱，收集洗脱液，于水浴锅上挥干溶剂[12]，即得硫磺菌子实体提纯后的生物碱类化合物（以下简称提取物A）。

2.2 提取物A对植物病原真菌抑菌活性试验

参照参考文献[8]，精密称定1.26 g硫磺菌子实体提取物A，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇制成含提取物A浓度为1 mg·mL-1的备用溶液。用无菌的超滤膜过滤后，分别吸取适量加入无菌PDA培养基，制成含提取物A浓度分别为100 μg·mL-1和10 μg·mL-1的培养基。甜菜碱培养基（浓度分别为100 μg·mL-1和10 μg·mL-1）也按照上述方法制成，以空白培养基作对照（CK）。将培养基放置在通风橱中24 h，挥发去除95%乙醇溶剂，每个样品设3个重复。用直径为6 mm的打孔器打取生长整齐一致的2种病原真菌菌饼（小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌），再将病原真菌菌饼移植到各处理培养基的中心。1个培养皿1个菌饼，使菌丝面向下接触培养基，培养箱中28℃培养3 d～5 d。根据菌落直径平均值大小，计算出相应的抑菌率（E，%），公式为：

式中：a为各处理培养基中菌落直径（mm）；b为空白对照中菌落直径（mm）。

2.3 提取物A与广谱抗菌药的抑菌作用比较

参照参考文献[13]，取提取物A，加95%乙醇至溶解，再用无菌的超滤膜过滤，后用无菌PDA培养基制成梯度为 3.20 mg·mL-1、1.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1、 0.40 mg·mL-1、 0.20 mg·mL-1、 0.10 mg·mL-1及0.05 mg·mL-1的供试培养基。百菌清与多菌灵为农药广谱性杀菌剂，用无菌水分别稀释经精密称定的98%多菌灵和75%百菌清，用无菌的超滤膜过滤。后加入无菌的PDA培养基，制成含98%多菌灵培养基浓度梯度为 15 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、1 μg·mL-1的培养基[13]和 75%百菌清培养基浓度梯度为20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1、5.00 mg·mL-1、2.50 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1的培养基[15]，以空白培养基作对照（CK）。将培养基放置在通风橱中24 h，以挥发去除95%乙醇溶剂，每个样品设3个重复。用直径为6 mm的打孔器打取生长整齐一致的2种病原真菌菌饼（小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌），再将病原真菌饼移植到各处理培养基中心。1个培养皿1个病原真菌菌饼，使菌丝面向下接触培养基，培养箱中28℃培养3 d～5 d。根据菌落直径平均值大小，按照2.2中的公式计算出相应的抑菌率（%）。

2.4 提取物A的抑菌作用

取2.2中培养3 d和7 d的供试病原真菌，同时使用纯化的小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌作为对照。在经过灭菌后的载玻片上滴1滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量菌丝制成玻片，显微镜观察并拍照。

2.5 数据分析与处理

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 26软件进行数据分析，Origin 2018软件进行作图。

3 结果与讨论

3.1 结果分析

3.1.1 提取物A对植物病原真菌的抑菌活性

不同浓度提取物A对植物病原真菌表现出不同程度的抑菌作用，抑菌效果见图1、表3。

表3 不同浓度提取物A和甜菜碱对2种植物病原菌的抑制率Tab.3 Inhibition ratio of different concentrations of extract A and betaine on two plant pathogens

图1 提取物A对2种植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of extract A on two plant pathogens

如图1、表3所示，提取物A和甜菜碱对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌均有一定的抑制效果。当提取物A浓度为100 μg·mL-1时，其对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制率分别是47.27%和43.48%；甜菜碱浓度为100 μg·mL-1时，其对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制率分别是34.66%和29.54%。随着浓度的下降，抑菌率也下降，浓度与抑菌率呈正相关性，由抑菌率可知，提取物A的抑菌效果较甜菜碱好。

3.1.2 提取物A与广谱抗菌药的抑菌比较

7种浓度的提取物A对小麦赤霉病菌及马铃薯干腐病菌的抑制作用情况见图2、表4。

图2 提取物A不同浓度对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制情况Fig.2 Inhibition effect of different concentrations of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表4 不同浓度提取物A对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用Tab.4 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如图2、表4所示，与空白培养基CK相比，提取物A对病原真菌的抑制作用具有显著性差异（P<0.05）。各浓度下提取物A均具有抑制小麦赤霉病菌的作用，其中浓度为1.6 mg·mL-1时对小麦赤霉病菌的抑制效果最佳，其抑菌率为88.42%。提取物A浓度为1.6 mg·mL-1时抑菌率大于浓度为3.2 mg·mL-1时抑菌率，而浓度小于1.6 mg·mL-1时，其抑菌率呈量效关系，证明1.6 mg·mL-1为其最大的抑菌浓度。各浓度提取物A均具有抑制马铃薯干腐病菌的作用，其中A浓度为3.2 mg·mL-1时对马铃薯干腐病菌抑制效果最佳，其抑菌率为86.46%，与其他浓度及CK的处理具有显著性差异（P<0.05），与浓度为1.6 mg·mL-1的处理无显著性差异 （P＞0.05）。

综上所述，小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌对提取物A比较敏感，与CK相比抑菌效果明显。提取物 A 为 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1对小麦赤霉病菌的抑菌效果较理想，其抑菌率分别是88.16%、88.42%及88.35%。但当提取物A浓度为 1.6 mg·mL-1与 3.2 mg·mL-1时，2 种浓度处理下的抑菌率无显著性差异（P＞0.05）。试验结果表明，硫磺菌子实体对供试的小麦赤霉病菌最大抑菌率为88.42%。提取物 A 浓度为 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及3.2 mg·mL-1对马铃薯干腐病菌的抑菌效果较理想，其抑菌率分别是86.23%、86.35%及86.46%。但提取物A为1.6 mg·mL-1与3.2 mg·mL-1时，对马铃薯干腐病的抑菌率无明显增加，且2种浓度处理下的抑菌率无显著性差异（P＞0.05）。试验结果表明，硫磺菌子实体对供试的马铃薯干腐病最大抑菌率为86.46%。从抑菌率表明，2种植物病原菌对提取物A表现出不同的敏感性，进而表现出不同的抑菌效果：小麦赤霉病菌>马铃薯干腐病菌。

5种不同浓度的多菌灵对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用情况见图3、表5。

如图3所示，5种不同浓度的多菌灵对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用情况不同，与未接多菌灵的空白培养基CK的抑菌率相比具有显著性差异（P<0.05）。不同浓度的多菌灵对小麦赤霉病菌均有抑菌作用，其中在多菌灵浓度为15 μg·mL-1、10 μg·mL-1及 5 μg·mL-1处理下对小麦赤霉病菌的抑制率较好，抑菌率均为100%。并且与3 μg·mL-1、1 μg·mL-1及 CK的处理相比较具有显著性差异（P<0.05）。如表5所示，不同浓度的多菌灵对马铃薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在浓度为15 μg·mL-1处理下对马铃薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率为100%，与其他浓度及CK相比具有显著性差异（P<0.05）。

图3 不同浓度的多菌灵对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑菌效果Fig.3 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表5 多菌灵对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用Tab.5 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

综上所述，采用98%多菌灵作为抑菌对照试验组，2种植物病原菌中，多菌灵对小麦赤霉病菌表现出明显的抑制作用的浓度为5 μg·mL-1，对马铃薯干腐病菌的抑制作用的浓度为15 μg·mL-1。多菌灵为15 μg·mL-1，对2种植物病原真菌的抑菌率相同；浓度小于15 μg·mL-1时，其抑菌率大小为小麦赤霉病菌>马铃薯干腐病菌，抑菌作用和质量浓度变化呈正相关性，随着药物浓度减小，抑制效果明显减小。

5种不同浓度的百菌清对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用见图4、表6。

图4 不同浓度的百菌清对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑菌效果Fig.4 The antimicrobial antimicrobial acivity of different concentrations of chlorothalonil on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如图4所示，5种不同浓度的百菌清对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑制作用与空白培养基CK相比具有显著性差异（P<0.05）。如表6所示，不同浓度的百菌清对小麦赤霉病菌均有抑菌作用，其中百菌清浓度为20 mg·mL-1的处理对小麦赤霉病菌的抑制率最佳，抑菌率为100%，且与其他浓度相比具有显著性差异（P<0.05）。如表6所示，不同浓度的百菌清对马铃薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在百菌清浓度为20 mg·mL-1处理下对马铃薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率为100%，且与其他浓度及CK相比具有显著性差异（P<0.05）。综上所述，百菌清对马铃薯干腐病菌和小麦赤霉病菌现出明显抑制作用的MIC值为20 μg·mL-1，对小麦赤霉病菌的抑制作用减弱。其抑菌率，马铃薯干腐病菌>小麦赤霉病菌，抑菌作用和质量浓度变呈正相关性，随着药物浓度减小，抑制效果明显减小。

3.1.3 3种药物对同种植物病原菌的抑制能力

广谱抗菌药和硫磺菌提取物对2种植物病原菌的抑制效果见图5、图6。

图5 各处理对小麦赤霉病菌的抑制效果Tab.5 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium gramineaanum

图6 各处理对马铃薯干腐病菌的抑制效果Fig.6 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium coeruleum

如图5、图6所示，提取物A与其他2种药物对2种供试菌种都有明显的抑菌效果。对于小麦赤霉病菌，多菌灵的抑菌能力强于提取物A和百菌清；而对于马铃薯干腐病菌，百菌清抑菌能力强于多菌灵与提取物A的抑菌能力。

3.1.4 显微观察提取物A的抑菌作用

试验发现，经过处理的供试品小麦赤霉病菌在培养3 d后菌丝变细萎缩、产生畸形及颜色变浅等现象，而小麦赤霉病菌CK则未有此类现象发生；经过处理的供试品马铃薯干腐病菌在培养3 d后菌丝体出现菌落生长畸形和菌丝生长量变少，菌丝形态和结构发生变化，而马铃薯干腐病菌CK则未有此类现象发生。显微观察培养7 d后，提取物A对2种植物病原菌的抑制作用，结果见图7。

图7 培养7 d后提取物A对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病的抑菌作用的显微镜观察图Fig.7 Microscopic observation of the antimicrobial activity of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum cultured for 7 days

如图7所示，经过处理的供试品小麦赤霉病菌在培养7 d后分生孢子出现明显的膨大及畸形，导致芽管肿胀和扭曲菌等现象，而小麦赤霉病菌CK则未有此类现象发生；经过处理的供试品马铃薯干腐病菌在培养7 d后孢子萌发量减少，菌丝出现变小、变短或断裂及畸形等现象，而病原菌CK则未有此类现象发生。

3.2 讨论

近年来，用生物抗菌剂以替代或部分替代化学杀菌剂的研究越来越受到重视，王娟等[16]研究表明，硫磺菌菌丝体发酵液的乙酸乙酯萃取物浓度为50 mg·mL-1，对小麦赤霉、辣椒疫霉及黄瓜炭疽病菌均显示出较强的抑菌效果，对甘薯黑斑、烟草赤星、苹果腐烂及小麦腐病菌具有较强的抑菌效果。本试验结果表明，小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌对提取物A比较敏感，当提取物A浓度为0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1时对小麦赤霉病菌的抑菌率分别是88.16%、88.42%及88.35%；硫磺菌子实体对供试的马铃薯干腐病最大抑菌率为86.46%。表明2种植物病原菌对硫磺菌子实体粗提取物表现出不同的敏感性，进而表现出不同的抑菌效果，即对小麦赤霉病菌的抑菌效果优于对马铃薯干腐病菌的抑菌效果。研究结果表明以甜菜碱为代表的生物碱类成分为硫磺菌子实体活性物质之一，为其生物抗菌剂的开发提供了参考。

人们长期使用多菌灵类及百菌清类杀菌剂，导致我国多数地区的小麦赤霉病菌对此类杀菌剂已经逐渐产生抗药性[17-18]，最主要原因是此类杀菌剂与病原菌的亲和性正在逐渐下降[9]。再者，多菌灵有低毒，残留高，对人类皮肤和眼睛有刺激，口服中毒会出现头昏、恶心及呕吐等现象[19]；百菌清对生态环境破坏严重，残留高，更会对人体造成致癌的风险，WHO在2017年10月27日发布的《致癌物清单》中，百菌清名列2B类致癌物。现代农业上迫切需要一种具有高效、长效、广谱、稳定、无毒及对生态环境无污染的生物抗菌剂，本研究结果表明，提取物A对小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌均有明显的抑制效果。虽然对小麦赤霉病菌及马铃薯干腐病菌的抑制能力低于多菌灵和百菌清，但其来自于天然成分，可以避免长期使用多菌灵和百菌清引起的弊端，值得进一步开发研究。

研究结果表明提取物A对2种植物病原真菌的抑菌作用优于甜菜碱，说明以甜菜碱为代表的生物碱类成分为硫磺菌子实体活性物质之一，下一步应对其他的活性成分进一步研究。