不同桑黄菌株生长特性及发酵液的抗氧化活性*

李学震，和法涛，马艳蕊，刘光鹏，初 乐，郑明珠

（1.中华供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250220；2.吉林农业大学，吉林 长春130118）

桑黄菌（Sanghuangporus spp.）是一类黄褐色多年生稀有真菌，通常生长在桑树上，属真菌界（Fungi）担菌子门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes） 锈革孔菌目（Hymenochaetales） 锈革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 桑黄属 （Sanghuangporus）[1]。粗毛纤空菌 [Inonotus hispidus(Bull.:Fr)P.Karst]，属于锈革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 纤孔菌属（Ionnouts），有学者认为粗毛纤空菌是传统中药“桑黄”，与桑黄菌有相似功效[2]。在中国、韩国和日本等亚洲国家，桑黄常作为传统中药用于治疗口腔溃疡、胃肠疾病、淋巴疾病和癌症等[3-4]。据报道，桑黄有抗炎症、提高免疫和抑制肿瘤生长等作用[5-6]，其抗氧化能力也引起了大量学者的关注，桑黄能清除人体内过量的自由基，并且这些自由基与炎症、肿瘤和免疫下降的发生相偶联[7]。如王一菲等[8]和闫景坤等[9]研究了不同桑黄抗氧化能力的相关指标，表明不同桑黄的抗氧化作用有显著区别。

以往关于桑黄的研究大多集中在子实体活性物质的提取与活性评价，但野生桑黄受季节影响，生长缓慢，数量少不易获得，而人工栽培比较困难[10]。因此，有研究人员利用液体发酵生产桑黄菌丝体，并从中提取活性成分，从而验证了桑黄菌丝体黄酮比子实体黄酮有更强的抗氧化效果[11]。姜福春等[12]在发酵过程中添加乙酸镁可促进菌丝体的产量和黄酮类物质的积累，且增强了体外抗氧化活性。

通过研究不同桑黄菌株生长特性，旨在对不同桑黄菌株的抗氧化能力进行比较，以期全面认识桑黄的生长特性和抗氧化特性，并为筛选适用于固体培养和液体发酵的桑黄提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

供试6个菌株，均由山东省临清市哲硕农产品有限公司提供，菌株情况详见表1。

表1 菌种信息Tab.1 Information of strains

1.2 培养基及试剂

1.2.1 培养基

PDA培养基，青岛宾得生物技术有限公司；PDB培养基，北京索莱宝生物科技有限公司。

POD培养基，在PDA培养基中加入0.05%愈创木酚配置而成。

羧甲基纤维素培养基：羧甲基纤维素钠5 g、七水硫酸镁1 g、磷酸二氢钾2 g、琼脂15 g，蒸馏水1 L。

液体发酵培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、酵母粉2 g、磷酸二氢钾1.5 g、七水硫酸镁0.75 g、氯化钙0.75 g，蒸馏水1 L。

1.2.2 其他试剂

磷酸氢二钠，天津科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、三氯化铁、愈创木酚，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司；硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾，天津大茂化学试剂厂；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希爱化成工业发展有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.3 试验仪器

BSC-150恒温培养箱、YXQ-LS-100A型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-1000型紫外分光光度仪，上海天美科学仪器有限公司；TDL-5A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器；ME-104型万分之一天平，梅特勒托利多仪器有限公司；HH-4型显数恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；R308型旋转蒸发仪，上海申生物科技有限公司，ZWYR-2112B型恒温调速摇床柜，上海智诚分析仪器制造有限公司，FD-2型真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种平板活化与制备

取分离纯化后的斜面菌株，在无菌操作台上取0.5 cm2接入PDA平板，菌株长到4 cm～6 cm时，保存在4℃冰箱备用，使用前在28℃培养箱中恒温6 h。

1.4.2 菌株生长速度测定

根据曲德辉等[13]的方法进行测定。

1.4.3 发酵菌丝生物量测定

发酵种子液制备：取平板上的菌丝，用直径5 mm的打孔器打孔，使用250 mL的瓶子，装液量为100 mL，每瓶接种 4块。28℃、120 r·min-1振荡培养7 d，待菌丝长满摇瓶，用手持搅拌器在无菌操作台内将菌丝打散，但不破坏细胞，放入4℃冰箱备用，使用前在摇床28℃恒温6 h。

液体发酵培养：将制备好的6个菌株的液体种子液接入PDB培养基中，接种量为10%，使用500 mL的瓶子，装液量为200 mL，每个菌种3瓶。28℃、20 r·min-1振荡培养7 d。将培养发酵液5 000 r·min-1离心10 min，沉淀的菌丝体用蒸馏水清洗3次～5次，冻干称重，上清液放入4℃冰箱保存以测定抗氧化活性。

1.4.4 相对酶活性测定

漆酶相对活性根据参考文献[14]的方法进行测定。

羧甲基纤维素酶相对活性测定根据文献[15]的方法进行测定。

1.4.5 发酵液抗氧化能力测定

1） 羟自由基清除能力测定

根据参考文献[16]的方法并做一些改进，取8 mmol·L-1的FeSO4溶液和水杨酸溶液各1 mL混合，取制备好的发酵液各0.1 mL，加入混合液中震荡摇匀。之后加入3%的H2O2溶液1 mL继续震荡摇匀使其充分反应，在水浴锅中37℃保温30 min，510 nm测定吸光值。羟自由基清除率（E1，%）计算公式为：

式中：A1为样品反应体系的吸光度值；A2为去离子水代替H2O2反应体系的吸光度值；A0为去离子水代替样品反应体系的吸光度值。

2）DPPH自由基清除能力测定

根据参考文献[17]的方法进行测定，准确称取DPPH试剂5 mg，溶于250 mL无水乙醇中，此时DPPH溶液浓度为0.02 mg·mL-1。取制备好的发酵液各0.1 mL加入3.9 mL的DPPH溶液中，常温避光20 min，517 nm处测吸光度值。DPPH自由基清除率（E2，%） 计算公式为：

式中：A3样品反应体系的吸光度值；A4为无水乙醇代替DPPH溶液反应的吸光度值；A0为无水乙醇代替样品反应体系的吸光度值。

3）相对还原力测定

根据参考文献[18]的方法进行测定，取0.5 mL发酵液加入0.6 mL的PBS缓冲液（0.2 mol·L-1、pH 6.6） 和质量分数1%的铁氰化钾1.5 mL。混匀后50℃，保温20 min，取出冷却后，加入10%三氯乙酸2.5 mL。取混合液2.5 mL加2.5 mL蒸馏水和质量分数0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，静置10 min后于700 nm处测吸光度值。

1.4.6 数据分析

采用 SPSS 22、Origin 9.0和 GraphPad Prism 8进行处理和图形绘制。

2 结果与分析

2.1 菌株生长特性

2.1.1 不同桑黄菌株平板培养生长状态

6种桑黄菌株的生长特性见表2。

表2 不同桑黄菌株平板培养生长状态Tab.2 The growth state of the flat plate culture of different Sanghuang strains

如表1所示，在相同培养条件下，不同桑黄菌株平板生长的菌丝密度有很大差异，其中东北桑黄D、杨树桑黄Q和粗毛纤孔菌182的菌块厚，菌丝密集；杨树桑黄Q和粗毛纤孔菌124菌块略薄，但菌丝密集；韩国桑黄H菌块最薄，且菌丝稀疏，这可能与菌丝的生长速度有关。

2.1.2 不同桑黄菌株生长速度

6个桑黄菌株的生长曲线见图1，生长速度见图2。

图1 不同桑黄菌株生长曲线Fig.1 Growth curve of different Sanghuang strains

图2 不同桑黄菌生长速度Fig.2 Growth rates of different Sanghuang strains

如图1、图2所示，从生长曲线的斜率可以看出东北桑黄D和杨树桑黄Q从接种后生长速度一直高于其他4个桑黄菌株。从第3天开始，东北桑黄D的生长速度有较明显的上升，略微下降后，在第6天明显上升，而杨树桑黄Q生长速度一直保持平稳。其他5个桑黄菌株在前3 d前生长速度相差较小，之后韩国桑黄H的生长速度保持平稳，而粗毛纤孔菌182在第6天生长速度超过杨树桑黄Q和粗毛纤孔菌124。11 d后东北桑黄D最先长满平板，6个桑黄菌株的平均生长速度依次为东北桑黄D＞杨树桑黄Q＞粗毛纤孔菌182＞粗毛纤孔菌124＞桑树桑黄Y＞韩国桑黄H。

2.1.3 不同桑黄菌液发酵菌丝生物量

桑黄菌液发酵菌丝生物量统计见图3。

图3 不同桑黄菌株菌丝生物量Fig.3 Mycelium biomass of different Sanghuang strain

如图3所示，在相同培养时间内，粗毛纤孔菌182的菌丝生物量最高达（1.23 g）；而杨树桑黄Q、桑树桑黄Y和粗毛纤孔菌124的菌丝生物量相差不大，分别为1.11 g、1.13 g和1.07 g；产量最低的是韩国桑黄H，菌丝生物量仅有0.73 g。值得注意的是东北桑黄D菌丝生物量只超过了韩国桑黄H，与其平板培养的生长速度不一致，这表明东北桑黄D适用于固态发酵，而粗毛纤孔菌182适用于液体发酵。

2.2 不同桑黄菌株相对酶活性

漆酶和羧甲基纤维素酶能分解木质素和纤维素为桑黄菌丝生长提供养料，同时参与氧化呼吸过程中的电子链传递，为桑黄生长提供更多能量并促使菌丝体内物质合成和积累[19]。以变色圈大小表示漆酶和羧甲基纤维素酶活性的高低，即变色圈越大酶活性越高，6个菌株漆酶和羧甲基纤维素酶活性试验结果见表3。

如表3所示，6个菌株的2种酶活性差异较大，羧甲基纤维素酶活性最强的是东北桑黄D，其次是杨树桑黄Q和桑树桑黄Y，而粗毛纤孔菌124未检出羧甲基纤维素酶；漆酶活性最高的是韩国桑黄H，但6个菌株漆酶活性差异并不显著。

表3 不同桑黄菌株相对酶活性Tab.3 Relative enzyme activity of different Sanghuang strains

2.3 发酵液抗氧化能力

2.3.1 羟自由基清除率测定

6种桑黄羟自由基清除率见图4。

图4 不同桑黄菌株羟自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rates of different Sanghuang strains

如图4所示，杨树桑黄Q和东北桑黄D发酵液的羟自由基清除率最高，分别达到85.39%和72.28%，其次是韩国桑黄H和桑树桑黄Y，分别达到70.96%和62.68%，清除率最低的是粗毛纤空菌182和124，分别为53.18%和51.75%。

2.3.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基，在517 nm处有最大吸收波长，当加入抗氧化物质时，自由基被清除，其在517 nm处的最大吸收会减少[20]。因此可以通过检测517 nm处的吸光度值来判断活性物质的DPPH自由基清除活性。6个桑黄菌株发酵液的DPPH自由基清除能力结果见图5。

图5 不同桑黄菌株DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rate of different Sanghuang strains

如图5所示，东北桑黄D和粗毛纤孔菌182的清除率最高，分别为91.93和86.73%。其余4个桑黄菌株的DPPH自由基清除率均不超过80%，最低的是杨树桑黄Q，清除率仅为57.58%。

2.3.3 相对总还原力测定

还原性物质能使铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，与反应体系中的三氯化铁进一步反应生成普鲁士蓝Fe4[Fe(CN)6]3，在700 nm处有最大吸收值，且吸光度值越大表明还原能力越强[21]。6个桑黄菌株发酵液中还原力结果见图6。

图6 不同桑黄菌株相对总还原力Fig.6 Relative total reduction force of different Sanghuang strains

如图6所示，相对总还原力最高的是东北桑黄D，其次是粗毛纤孔菌182，结果与DPPH清除能力结果相似，其余4个桑黄菌株发酵液相对还原力大小为桑树桑黄Y＞粗毛纤孔菌124＞韩国桑黄H＞杨树桑黄Q。

3 结论

以6个不同桑黄菌株为研究对象，利用固体培养和液体发酵观察桑黄的生长状态，考查桑黄菌的生长速度及菌丝生物量，比较不同桑黄菌株漆酶和羧甲基纤维素酶的相对活性，通过测定羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和总还原力评价桑黄抗氧化能力。结果表明，菌丝密度与桑黄生长速度呈正相关；菌丝生物量结果表明，东北桑黄D适用于固体培养而粗毛纤孔菌182适用于液体发酵；羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和总还原力测定表明，东北桑黄D和粗毛纤孔菌182均有较强抗氧化能力。试验结论为桑黄类真菌的发酵培养提供了新的评价依据，也为桑黄类真菌抗氧化活性物质的进一步深入研究奠定基础。