三黄凝胶对耳郭痤疮模型大鼠血清IL-17、IL-23水平的影响

李炳男，郭斐斐，刘 婧，牛凡红，王思农

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

痤疮是累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，好发于颜面部，青春期人群更为常见，严重程度不一[1-2]。临床上常表现为不同程度的皮肤损伤，如黑头或白头粉刺、丘疹、脓疱、结节等，且易反复发作，愈后易遗留色素沉着或瘢痕[3]，这不仅影响美观，还会对患者的心理、社交造成不良的影响[4]。目前西医临床治疗痤疮主要采用维A酸类和激素类等药物,疗效确切，但长期使用易产生耐药性、复发率高等问题。中医药的治疗优势被越来越多的患者所认可，研究证实部分中药有调节内分泌、抑制皮脂分泌、抗炎等作用[5]。本实验观察了三黄凝胶对耳郭痤疮大鼠血清中白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-23(IL-23)水平的影响，旨在探讨三黄凝胶治疗痤疮的机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级Wistar大鼠50只，体重(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学动物实验室提供，实验动物许可证号:SYXK(甘)2005-001。常规饲养于甘肃中医药大学实验室动物房，给固定配方的标准饲料，自由进食进水，适应环境后开始实验。实验经甘肃中医药大学伦理委员会批准(2019-116)。

1.2实验药物及试剂 三黄凝胶 (3.6 g生药/10 g，窑街煤电集团有限公司总医院， 批号：Z20160001)；0.025 %维A酸乳膏(商品名：迪维，重庆华邦制药有限公司，国药准字H50021817，规格：15 g/支)；煤焦油 (广东恒健制药有限公司提供，批号:H44024241)；大鼠血清ELISA IL-17和IL-23试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.3主要仪器 DW-8W118S低温保存箱(无锡冠亚恒温制冷技术有限公司)，iMark酶标仪(美国伯乐有限公司)，D3024R台式离心机(美国SCILOGEX赛洛捷克)，DP72双目倒置显微镜(OLYMPUS公司)，PRACTUM612-1CN电子天秤(德国) 。

1.4实验方法 将 50只大鼠按体重由轻到重的顺序依次编号，按随机数表法随机取8只作为空白组，剩余42只大鼠进行造模：在右耳内侧面的耳导管开口处，约2 cm×2 cm的范围，用玻璃棒涂煤焦油，每日1次，每次约0.5 mL，连续涂抹21 d，隔日于鼠耳皮下注射痤疮丙酸杆菌菌液，每单耳0.1 mL。然后随机抽取2只造模大鼠，取耳部痤疮病变皮肤活检，用10 %福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色。参照痤疮模型镜下组织学观察的判定分级标准[6]，以光镜下皮肤角质层增厚，角栓堵塞、扩大呈壶状，毛囊口漏斗部见中量角化物质提示大鼠耳郭痤疮模型建成。将建模成功的40只大鼠按随机数字表法分为5组，每组8只。模型组不予涂擦任何药物；各干预组依据人与大鼠之间的用药剂量等效换算公式计算给药剂量，维A酸乳膏组给予0.025%维A酸乳膏5 g/(kg·d)右耳郭造模处涂擦，三黄凝胶低、中、高剂量组分别给予含生药0.02 g/(kg·d)、0.04 g/(kg·d)、0.08 g/(kg·d)的三黄凝胶右耳郭造模处涂擦，均每天1次，连续4周。

1.5观察指标及方法 造模和干预期间观察各组大鼠耳部皮损情况。末次用药24 h后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血5 mL，4 000 r/min离心5 min后取上清液，-80 ℃冰箱中备用，严格按照IL-17、IL-23的ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-17、IL-23水平。颈椎脱臼法处死大鼠，切取患处耳部组织，用10 %福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察组织病理情况。

2 结 果

2.1各组大鼠造模期间耳部皮损变化 空白组大鼠耳郭外观呈淡红色，可清晰地看到毛细血管的分布，触之柔软，无红肿现象，内耳导管的开口处无角化物质分泌。各造模组大鼠造模结束后，耳郭皮肤色红，伴有肿胀，触之皮温升高，可见明显表皮增厚，且质地粗糙，有较严重的脱屑、痂皮症状，毛囊孔增大。

2.2各组大鼠干预期间耳部皮损变化 空白组大鼠与之前相同。模型组大鼠皮损未见明显好转。干预1周后，各干预组大鼠耳郭皮肤症状开始减轻，颜色较前变淡，触之质地变软，皮温有所下降，表皮厚度变薄，部分痂皮也开始脱落。干预4周后，三黄凝胶低剂量组大鼠耳表皮增厚有所减轻，毛囊角栓和结节明显减少，但仍有较多未治愈粉刺存在；三黄凝胶中剂量组大鼠耳表皮厚度正常，毛囊角栓和结节显著减少，但仍有少量脱屑现象；三黄凝胶高剂量组大鼠耳皮肤颜色接近正常，皮温正常，触之质地柔软、无肿胀，无脱屑及痂皮现象，基本恢复正常状态；维A酸乳膏组大鼠皮损恢复状态与三黄凝胶中剂量组相近。

2.3各组大鼠血清IL-17、IL-23水平比较 模型组大鼠血清IL-17、IL-23水平均明显高于空白组(P均<0.05)；各干预组大鼠血清IL-17、IL-23水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且三黄凝胶高剂量组均明显低于维A酸乳膏组(P均<0.05)，三黄凝胶低、中剂量组与维A酸乳膏组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和耳郭痤疮各组大鼠血清IL-17、IL-23水平比较

2.4各组大鼠耳组织病理学表现 光镜下观察，空白组大鼠耳组织结构清晰，细胞排列有序，表皮组织较薄，毛囊、皮脂腺清晰可见，角化无异常；模型组大鼠耳表皮组织增厚，皮脂腺增大，毛囊扩大成壶状，同时致密的角化物质充满了毛囊口和漏斗部；三黄凝胶低剂量组毛囊口扩张程度有所减轻，其内角化物疏松，炎性细胞较模型组减少；三黄凝胶中剂量组和维A酸乳膏组可见毛囊口扩张程度减轻，炎性细胞减少，表皮略微增厚；三黄凝胶高剂量组炎性细胞显著减少，表面附有薄层角质层。见图1。

图1 正常组和耳郭痤疮各组大鼠耳组织HE染色病理表现(×100)

3 讨 论

痤疮的病因尚不明确，现代医学认为与皮肤的炎性反应密切相关[7-8]。Th17是诱导炎性发生的重要细胞，IL-17和IL-23是Th17细胞发挥作用的主要相关细胞因子，Th17细胞通过IL-23/IL-17炎症轴，在自身免疫性疾病及炎性疾病中发挥重要作用[9-10]。IL-17 是T细胞诱导的炎性反应的早期启动因子，能够募集和激活单核细胞、中性粒细胞在炎性部位聚集[11]，增加细胞渗透性，并诱导炎性反应[12]。同时IL-17有强大的致炎性，可诱导其他促炎细胞因子和趋化因子的表达，并促进炎性级联反应的发生和发展[13]，加重局部组织的炎性反应。IL-23是由活化的树突状细胞、巨噬细胞及单核细胞分泌的促炎因子[14]，可以通过诱导、驱动Th17细胞的分化，以产生IL-6、IL-17和IFN-γ，从而引起炎症细胞因子的级联反应[15-16]。IL-23本身还可以通过记忆T细胞的扩增产生大量巨噬细胞来促进单核细胞分化，与IL-1一起参与炎症反应[17-18]。IL-17诱导、刺激产生的前炎性因子(IL-1、IL-6等)可进一步引起IL-23的过表达。因此，IL-17、IL-23可能在痤疮的发病中起着重要作用。

中医认为痤疮可因素体阳热偏盛，肺经蕴热，复受风邪，亦可由于后天失养，嗜食辛辣肥甘厚味，湿热互结以及失眠熬夜、酗酒吸烟等不良生活习惯，导致肺胃火热熏蒸颜面，诱发本病[19]。本实验选用的三黄凝胶是在三黄膏的基础上改变剂型得来的。三黄膏是治疗痤疮的传统中医外用制剂，主要组成有黄连、黄芩、黄柏、冰片、麻油和凡士林等。由于传统加工工艺简单，使之存在有效成分析出有限、吸收较慢、用药后色素沉着的问题。因此，三黄凝胶新增具有美白功效的茯苓、白及、白芷等药物，再结合现代制剂工艺，将卡波姆作基质并加入促透剂(月桂氮酮)、调节剂(三乙醇胺)，使之透皮吸收快、显效快，色素沉着减少，更易涂抹，携带方便，更易被患者所接受。方中黄芩、黄柏、黄连为君药，具有清热解毒消肿的功效，且黄芩内含黄酮类物质，可以抑制炎性介质释放[20]，从而达到抗炎的效果，黄芩苷可减轻细胞过多地分泌雄性激素，有效防止复发；黄连中的小檗碱成分有很好的抗菌活性，同时也能有效抑制急慢性炎症[21]。苦参、当归、丹参为臣药，苦参有祛风逐湿之功，能助三黄之药效；丹参有凉血消肿、祛瘀祛瘢之功，且丹参有抑制真菌繁殖、减轻炎症反应、促进组织修复与再生的作用[22]；当归有活血养血之功，且化瘀而不伤血，还可增强机体的特异性及非特异性免疫功能[23]；白芷、白及、茯苓为佐药，均具有消肿功效，同时白芷可抑制黑素细胞合成，减少色素沉着[24]；白及可作为天然的乳化剂，可诱导免疫调节因子的表达，白及胶浆有较强的抑菌作用，易在局部形成保护膜[25-26]；薄荷、冰片为使药，能引药直达病所，以助三黄散毒去疮。全方共奏清热解毒、消肿止痛、活血化瘀之功。

本实验结果显示，痤疮模型大鼠血清IL-17、IL-23水平明显高于空白组，提示IL-17、IL-23在痤疮的发病中起着重要作用。干预结束后，三黄凝胶低剂量组大鼠仍有较多未治愈粉刺，三黄凝胶中、高剂量组和维A酸乳膏组大鼠痤疮皮损均明显减轻，三黄凝胶高剂量组基本恢复正常且镜下仅见少量炎性细胞；各干预组大鼠血清IL-17、IL-23水平均较模型组低，其中三黄凝胶高剂量组均明显低于其他组。提示三黄凝胶可有效治疗痤疮， 推测其可能通过抑制IL-17、IL-23的分泌，控制炎性反应从而发挥作用，也说明通过抑制IL-17、IL-23治疗痤疮是可行的。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。