盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、自噬及MAPK通路影响的研究

田 华，付小卫，王 晖

(1. 陕西中医药大学，陕西 西安 712046；2. 陕西省人民医院，陕西 西安 710061)

胃癌是全世界常见的恶性肿瘤之一，发病率居肿瘤发病率的第五位，在恶性肿瘤中病死率位居第三位[1]。我国胃癌新发病例在恶性肿瘤新发病例中位居第二位[2]，这已严重危害了人类的健康。近些年胃癌的整体治疗效果没有取得突破性进展，从具有抗癌活性的中药中提取、纯化有效的抗肿瘤成分成为目前医学研究的热点。盐酸小檗碱是一种常见的异喹啉类生物碱，其药理作用广泛，在临床上被广泛用于治疗各种消化系统感染性疾病[3]。近年来，其抗肿瘤作用也得到了广泛的关注和研究。本实验期望通过研究盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、自噬及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响，探讨盐酸小檗碱对胃癌治疗作用的可能机制，可望为盐酸小檗碱的抗肿瘤作用提供一些实验依据。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 胃癌SGC-7901 细胞，购自中科院上海细胞库，由陕西中医药大学实验室常规培养。

1.2试剂 盐酸小檗碱(Sigma，纯度≥98%),RPMI-1640培养液,胎牛血清,胰酶,PBS,SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，结晶紫染色液，CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，细胞凋亡-Hoechst染色剂试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)，抗体Bax(bs-0127R),Bcl-2(bs-0032R),Caspase-3(bs-0050R),微管相关蛋白轻链3(LC3)(bs-8878R),Beclin 1(YS-E93248),RAS(YS-19264R),p38(BM4142)。

1.3仪器设备 细胞培养箱、小型离心机、96孔板、R系列旋转蒸发仪(上海申花科技有限公司)，311型CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，IC1000型Countstar自动细胞计数仪(美国Inno-Alliance Biotech公司),VICTOR X5型酶标仪(美国 Perkinelmer公司)，FC 500型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，Mini-proteanTetra System小型垂直电泳槽，Mini Trans-Blot小型转印槽，Chemi Doc Touch高灵敏度化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养 将胃癌SGC-7901细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，置于培养箱中培养(37 ℃,5% CO2)。待细胞贴壁达80%～90%后用胰酶消化，1∶3传代至新的细胞培养基中继续培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2细胞增殖CCK-8检测 实验分为空白组及盐酸小檗碱0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 g/L组。取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞，用胰酶消化后制备成细胞悬液，以每孔4×105个的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。将培养板于培养箱(37 ℃,5% CO2)预培养24 h，空白组采用10%FBS培养基培养，盐酸小檗碱各组向10%FBS培养基中加入相应浓度的盐酸小檗碱培养，每组6个复孔，在培养箱中培养24 h、48 h、72 h。培养结束后避光加入CCK-8溶液，每孔10 μL(不要生成气泡), 将培养板在培养箱中孵育3 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)，细胞存活率= A盐酸小檗碱组/A空白组×100%。重复实验3次。

1.4.3细胞凋亡流式细胞技术检测 实验分为空白组、盐酸小檗碱4 g/L组和盐酸小檗碱8 g/L组。取对数生长期的SGC-7901细胞按每孔4×105个的密度接种于6孔板中培养过夜。空白组采用10%FBS培养基培养，盐酸小檗碱4 g/L组和盐酸小檗碱8 g/L组向10%FBS培养基中加入相应浓度的盐酸小檗碱培养，于培养箱中(37 ℃,5% CO2)孵育48 h后胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞1次后全部加入15 mL管中。1 000 r/min离心5 min，用PBS洗涤3次，用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%酒精，固定，4 ℃过夜。次日将固定好的细胞以1 000 r/min的转速离心5 min，弃上清，加入4 mL PBS清洗1次。用0.4 mL PBS重悬细胞，加入5 μL RNaseA(10 mg/mL)37 ℃消化1 h，加入浓度50 mg/mL碘化丙啶(propidium iodide PI)4 ℃避光染色过夜，在EPICS XL流式细胞仪上分析。重复实验3次。

1.4.4凋亡、自噬及MAPK通路相关蛋白Western blot检测 实验分为空白组、盐酸小檗碱4 g/L组和盐酸小檗碱16 g/L组。盐酸小檗碱4 g/L组和盐酸小檗碱16 g/L组用含10% FBS培养基配制相应浓度盐酸小檗碱处理细胞，制备SGC-7901细胞悬液，收集细胞，PBS清洗3次后加入裂解液裂解细胞，13 000 r/min离心20 min，提取总蛋白上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性，置于-80 ℃ 冰箱保存。配SDS-PAGE胶、电泳、转膜，室温下3%脱脂牛奶封闭2 h，吸取封闭液，分别加入一抗β-actin(1∶1 000)，Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、Caspase-3(1∶2 000)，LC3Ⅰ(1∶2 000)、LC3Ⅱ(1∶2 000)、Beclin1(1∶2 000)、RAS(1∶2 000)、P38(1∶2 000)4 ℃过夜。次日复温2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入对应的二抗(1∶10 000)室温2 h，TBST再次洗膜3次，每次10 min，洗膜后使用发光液进行发光，利用Image Lab软件分析各条带的灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。重复实验3次。

2 结 果

2.1盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 盐酸小檗碱2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L组处理24 h、48 h、72 h后细胞存活率均明显低于空白组(P均<0.05)，且细胞存活率随着盐酸小檗碱浓度的增加逐渐降低，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和不同浓度盐酸小檗碱组胃癌SGC-7901细胞存活率比较

2.2盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响 空白组、盐酸小檗碱4 g/L组、盐酸小檗碱8 g/L组的细胞凋亡率分别为(3.08±0.72)%、(12.19±1.04)%、(22.27±1.65)%，盐酸小檗碱4 g/L组、盐酸小檗碱8 g/L组的细胞凋亡率明显高于空白组(P均<0.05)，且盐酸小檗碱8 g/L组明显高于盐酸小檗碱4 g/L组(P<0.05)。

2.3盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞凋亡相关蛋白的影响 与空白组比较，盐酸小檗碱4 g/L组、盐酸小檗碱16 g/L组Bax、Caspase-3蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)；盐酸小檗碱4 g/L组与盐酸小檗碱16 g/L组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 空白组和不同浓度盐酸小檗碱组胃癌SGC-7901细胞中凋亡相关蛋白表达情况

2.4盐酸小檗碱对胃癌SGC-7901细胞自噬相关蛋白的影响 与空白组比较，盐酸小檗碱16 g/L组Beclin 1、LC3Ⅱ蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)，盐酸小檗碱4 g/L组、盐酸小檗碱16 g/L组LC3I蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)；盐酸小檗碱16 g/L组LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表达量均明显高于盐酸小檗碱4 g/L组(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和不同浓度盐酸小檗碱组胃癌SGC-7901细胞中自噬相关蛋白表达情况

2.5盐酸小檗碱对MAPK通路的影响 与空白组比较，盐酸小檗碱4 g/L组、盐酸小檗碱16 g/L组RAS、p38蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)，盐酸小檗碱4 g/L组与盐酸小檗碱16 g/L组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图3 空白组和不同浓度盐酸小檗碱组胃癌SGC-7901细胞中RAS、p38蛋白表达情况

3 讨 论

胃癌患者早期无明显症状，导致早期诊断率较低，多数患者在诊断时即已发展为晚期，且胃癌有着高复发和转移的特点。因此在治疗上很多患者丧失了手术机会，这时化疗、靶向治疗为主的内科治疗在胃癌治疗中便占据了重要地位。虽然分子靶向药物的出现给肿瘤治疗带来了新的前景，但总体疗效却不尽如人意。近些年来大量的研究显示，中医药在治疗胃癌方面有着独特的优势。尤建良等[4]报道中药复方微调三号合剂治疗晚期胃癌可抑制肿瘤生长及转移,可提高患者生活质量。杨继泉等[5]采用中药治疗中晚期胃癌，结果生存期超过半年者占85.4%。肖真真等[6]实验观察到中药养正散结汤可明显遏制胃癌细胞的增殖，促进其凋亡。王新等[7]研究显示，盐酸青藤碱可通过线粒体凋亡途径诱导胃癌BGC-823细胞凋亡。赵行宇等[8]研究发现，6-姜烯酚可抑制胃癌BGC-823细胞侵袭及迁移。上述研究提示中医中药体内及体外均有抑制胃癌细胞生长的作用。

正常组织细胞增殖和凋亡保持着动态平衡，肿瘤是这个平衡被打破，增殖失控或凋亡失调的结果。肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞的增殖速度有关，还与肿瘤细胞的死亡有关。肿瘤细胞在癌变的进程中，获得了无限增殖的能力，其中凋亡缺失是肿瘤细胞无限增殖的主要原因之一。Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Caspase-3是Caspase家族的凋亡效应分子，处于凋亡级联反应的下游。在细胞凋亡过程中，Bcl-2和Bax通过从线粒体释放细胞色素C，激活凋亡级联反应，促进Caspase-3的活化并最终导致细胞死亡[9]。

研究表明，自噬在早期肿瘤的形成、中晚期肿瘤的增长、耐药及胃癌的转移中都起到了非常重要的作用[10-12]。Beclin 1是酵母Atg6哺乳动物的同源基因，是自噬调节的核心基因，参与自噬体的形成，Beclin 1可以介入自噬发生的全过程[13]。LC3是泛素样蛋白缀合系统，在自噬体隔离膜的延伸和扩展过程中起促进作用。LC3存在2种形式，即LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。细胞内新合成的LC3经过加工，成为胞质可溶形式的LC3Ⅰ，后者被进一步泛素化加工修饰，成为膜结合形式的LC3Ⅱ。LC3Ⅱ是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增多。LC3Ⅱ含量或LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比例与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性[14]。MAPK通路是与细胞自噬相关的信号通路之一，是细胞将信号从细胞膜传递到核内的主要通路，MAPK主要分为ERK1/2、JNK、p38 MAPK 3个亚族，其中p38 MAPK对自噬有重要的调控作用[15]。郭满等[16]研究证明骨桥蛋白依赖p38 MAPK信号通路发挥对Beclin 1的调节作用进而调控自噬。范晓圆[17]研究证实，盐霉素可通过诱导人胃癌BGC-823细胞的自噬来抑制肿瘤细胞生长。张晔等[18]研究发现，蟾蜍灵能通过诱导自噬抑制胃癌SGC-7901细胞生长。方悦等[19]用中药汉防己的提取物汉防己甲素作用于人胃癌BGC-823细胞，得到了与上述实验相似的结果。 本实验观察到盐酸小檗碱能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，促进其凋亡；蛋白表达检测提示盐酸小檗碱可诱导胃癌细胞发生自噬，上调MAPK通路上游RAS蛋白的表达，促进p38的磷酸化。故推测盐酸小檗碱能够通过调控Bax/Bcl-2蛋白的表达而抑制胃癌SGC-7901细胞增殖及促进其凋亡，可通过激活p38 MAPK信号通路诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬，为其用于胃癌的治疗提供了一定的实验依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。