外用加味四妙勇安油对大鼠急性放射性皮炎创面及组织形态学的影响

胡汉琼，廖子玲，康 宁，李 仝，宋凤丽

(1. 北京中医药大学,北京 100029；2. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

放射治疗是恶性肿瘤的重要治疗手段之一，放射线电离辐射在杀伤具体病灶的肿瘤细胞时，也损伤了正常组织细胞，可引起照射野内不同部位不同程度的炎症反应。其中最常见的是放射性皮炎，症状常表现为照射野局部瘙痒、疼痛、红斑、红肿、溃疡、渗出、脱屑、色素沉着、纤维化等。相关研究表明，91.4%的肿瘤患者在放射治疗期间会出现皮肤损伤，因放射性皮炎程度严重而导致中断放疗进程的概率高达58.1%[1]，因此放射性皮炎成为确保肿瘤患者治疗进程而亟待解决的问题。但目前国内外对于放射性皮炎的防治无统一治疗标准，仍处于探索阶段，多数是从外用辐射防护剂及乳膏等方面研究，例如奥克喷、三乙醇胺乳膏、磺胺嘧啶银乳膏、美宝湿润烧伤膏等，部分国外学者还从光生物调节疗法、医疗设备等方面进行了研究[2-3]。康宁等[4-6]基于北京中医药大学第三附属医院肿瘤血液科长期的临床用药经验及临床试验研究，发现外用加味四妙勇安油可能通过诱导免疫应答增强抗病能力，减少炎性因子释放，抑制炎症反应的发生从而促进急性放射性皮炎创面愈合。本研究通过肉眼及镜下观察皮肤的组织形态学变化探讨了加味四妙勇安油外用对大鼠急性放射性皮炎创面的影响，旨在进一步明确外用加味四妙勇安油的作用。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康Wistar雌性大鼠75只，购于斯贝福动物公司，饲养于中日友好医院临床研究所动物房，于SPF条件下饲养，室温20～25 ℃，相对湿度40%～70%，持续12 h明暗交替日光灯照明，以无菌消毒处理的标准鼠食饲养、饮水，自由活动，适应性喂养7 d后进行实验。实验动物饲养与处理遵守中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2药物制备 加味四妙勇安油由玄参90 g、金银花90 g、当归60 g、生黄芪30 g、紫草30 g、连翘30 g、蒲公英30 g、甘草10 g、冰片10 g等组成，上述药物均为配方颗粒剂(北京康仁堂药业有限公司)，将药物与葵花籽食用调和油(天津瑞佳讯贸易有限公司)200 mL混合加热至(100±1)℃，冷却后得到深褐色油剂即为加味四妙勇安油，整个制备过程在医院内进行。复方维生素B12溶液(贯新克)25 mL/瓶，长春精优药业股份有限公司，国药准字H10980223。

1.3主要仪器及试剂 医科达(Ekelta)直线加速器(瑞典)；HE染色试剂、天狼星红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；光学显微镜(ZEISS ImagerAl)。

1.4动物模型制备及分组干预 参照文献[7-8]并结合预实验结果，将75只雌性Wistar大鼠双后肢、臀部、全尾剃毛后，暴露在6MeV电子射线下,吸收剂量率400 cGy/min，照射距离1 m，照射时间10 min，吸收剂量40 Gy，对大鼠双后肢、臀部、全尾部位的皮肤照射1次，产生 10%Ⅱ度放射性皮炎，其他部位用铅砖遮盖。其症状包括躁狂、进食减少，照射野皮肤出现红斑、拒绝接受触碰等。采用随机数字表法将75只照射后的大鼠均分为3组：生理盐水组每日使用生理盐水对照射野进行常规护理，不进行给药处理；加味四妙勇安油组和复方维生素B12组在常规护理基础上，分别于照射处皮肤外涂四妙勇安油和复方维生素B12溶液，均1次/d,每次用药以均匀覆盖创面为宜。

1.5观察指标及方法

1.5.1一般情况及创面情况 每天观察各组大鼠精神状态、摄食进水等一般情况和创面皮损情况(如创面红肿、溃疡、渗出、皮肤新生等)。

1.5.2创面发生率 分别于照射后8 d、15 d、30 d、45 d、60 d，采用纸片增重法计算创面发生率。具体方法：将透明薄纸贴于创面上，勾勒出创面范围(即创面红肿、溃疡、渗出、新生的最大范围)，再以此为模板，将质地均匀的硬纸板剪成同样大小，然后将硬纸板称重并记录，其与整个照射野面积的纸板重量的比值×100%即为当天创面发生率，数值越小代表创面越小。

1.5.3皮肤组织形态学观察 每组分别于照射后8 d、15 d、30 d、45 d、60 d各处死5只大鼠，取照射区新鲜的皮肤组织，放置于盛有10%福尔马林液的离心管中固定，24 h后取出修整使切面平整，置入梯度酒精脱水、浸蜡包埋。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上连续切片成3 μm厚度。将切片漂浮于50 ℃温水表面展平，然后用防脱载玻片捞起，并放进60 ℃烘箱内烘烤，最后将烘好的切片室温保存备用。将制作好的石蜡切片进行HE染色及天狼星红染色。HE染色：常规脱蜡后切片置于Harris苏木素染色剂中染色10 min，1%盐酸酒精分化30 s，自来水中充分洗涤蓝化10 min，1%伊红水溶液染色10 min，自来水冲洗1 min。天狼星红染色：切片脱蜡后放入天狼星红饱和苦味酸液中1 h，自来水洗5 min，Mayer苏木素染液复染细胞核1 min，自来水洗10 min。染色完成的切片酒精逐级脱水，中性树胶封片，在光学显微镜下观察并摄片。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况及创面情况 生理盐水组：照射后10 d开始出现尾根部及足底轻度红肿，逐渐加重；15 d尾根部皮肤及足底部出现微小溃疡，伴有少量渗出，随后微小溃疡逐渐加大加深，尾根部皮肤溃疡成斑片状，大鼠进食减少，伴有躁狂状态；30 d创面达高峰，之后创面愈合很慢，且有扩大趋势；50 d溃疡周围可见少许新生皮肤，生长缓慢；60 d溃疡未完全收口。 加味四妙勇安油组：照射后14 d出现尾根部及足底轻度红肿，之后红肿有加重趋势；21 d尾根部皮肤出现微小溃疡，足底部红肿明显，大鼠拒绝触碰，之后皮肤溃疡增大，局部呈斑片状；35 d局部溃疡周围出现少许新生组织；45 d大鼠进食有所恢复，新生皮肤逐渐增多；60 d表面基本覆盖新生皮肤。复方维生素B12组：照射后10 d可见尾根部及足底轻度红肿，之后红肿逐渐加重；18 d大鼠尾根部皮肤及足底部出现微小溃疡，随后溃疡逐渐加深加大，伴有渗出，大鼠拒绝触碰，局部溃疡呈斑片状；30 d创面达高峰，未继续扩大；45 d溃疡周围出现皮肤新生组织；60 d大鼠皮肤溃疡未完全收口，新生皮肤增多，但未完全覆盖。

2.2各组大鼠创面发生率比较 照射后8 d各组大鼠均未发生创面；照射后15 d、30 d、45 d、60 d，加味四妙勇安油组和复方维生素B12组创面发生率均明显低于同期生理盐水组(P均<0.05)，且加味四妙勇安油组均明显低于复方维生素B12组(P均<0.05)，但照射后45 d、60 d 3组间整体比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组急性放射性皮炎大鼠照射后不同时间创面发生率比较

2.3各组大鼠皮肤组织HE染色形态 HE染色细胞核呈蓝紫色，细胞浆、基底膜、胶原纤维、肌纤维呈不同程度红色。 照射后8 d、15 d、30 d，生理盐水组大鼠皮肤组织中有较多淋巴细胞浸润，且有较多损伤细胞，即胞质红染、核固缩、核碎裂、核溶解等，炎症细胞于照射后30 d达到高峰，其后组织缓慢修复；加味四妙勇安油组和复方维生素B12组淋巴细胞浸润和损伤细胞明显较少，其中加味四妙勇安油组组织损伤程度更小且修复更快。 见图1。

图1 各组急性放射性皮炎大鼠照射后不同时间皮肤组织HE染色形态(×200)

2.4各组大鼠皮肤组织天狼星红染色形态 天狼星红染色普通光镜下观察胶原纤维呈红色，细胞核呈黄绿色。生理盐水组整体胶原纤维排列紊乱，可见部分断裂，组织损伤恢复缓慢；加味四妙勇安油组和复方维生素B12组胶原纤维排列较同期生理盐水组整齐，细胞核更饱满，形态更完整，组织损伤恢复较生理盐水组快。见图2。

图2 各组急性放射性皮炎大鼠照射后不同时间皮肤组织天狼星红染色形态(×200)

3 讨 论

放射性皮炎的发生机制在细胞方面主要是放射线损伤基底层细胞，基底层细胞作为表皮干细胞，损伤后无法不断分裂增殖形成表皮的各层细胞，最终导致放射性皮肤损伤；在分子生物学方面主要是电离辐射可产生大量自由基，使体内脂质与蛋白质氧化、大分子断裂，细胞因子异常表达，抗氧化酶表达不足，继而导致细胞死亡[9]。西医治疗主要是抗氧化、补充生长因子、抗菌抗感染、使用通过营造湿性环境促进愈合的药物等，但效果不理想[10]。

中医学将放射线归于“燥热邪气”，将放射性皮炎归于“烧烫伤”“疮疡”等疾病范畴[11]。该病病机为机体感受放射线热毒燥邪，辐射火毒蕴于卫分肌表，火热而燥，燥胜则干，可致局部瘙痒、红肿热痛、脱屑等；随后热毒循经入里，邪热灼伤营血分，皮肤可热盛肉腐、溃疡甚至出血。日久郁热存里、耗气伤津，局部皮肤气血经络凝滞阻塞，肌肤失于气血阴津荣养，从而导致局部皮肤干燥粗糙甚至纤维化。加之癌病素体痰凝、气结、瘀痹等病理产物，内外邪毒相合，病程缠绵难愈，从而严重影响放疗进程。因此针对放射性皮炎，可从卫气营血方面辨证施治，多选用清热解毒、去腐生肌、活血散瘀止痛的中药。古方四妙勇安方对于热毒壅盛的血管及皮肤病变具有悠久的历史验效，其首载于《石室秘录》：“金银花二两，当归二两，生甘草一两，玄参三两煎汤。日用一剂，七日仍服，疮口始能收敛而愈。”《验方新编》[12]中记载四妙勇安汤治脱骨疽:“初生或白色痛极，或如粟米起一黄泡。其皮或如煮熟红枣，黑色不退，久则溃烂，节节脱落，延至手足背腐烂黑陷，痛不可忍……再用金银花、玄参各三两，当归二两，甘草一两，水煎服。”此方仅四味药，但量大效专，清代医家鲍相墩言“一连十剂，永无后患”。现代国医大师禤国维善于运用四妙勇安汤加减治疗各种皮肤病，尤其是变应性血管炎、荨麻疹性血管炎、过敏性紫癜等皮肤血管炎，疗效显著[13]。现代研究认为四妙勇安汤具有抗炎、稳定斑块、降低血脂、保护血管、改善血液流变学、抗凝、抗血栓形成、镇静、镇痛的药理作用，广泛应用于内分泌系统疾病、心血管疾病、皮肤疾病、妇科疾病、风湿免疫疾病等[14]。有网络药理学研究筛选出20条通路验证四妙勇安汤多成分、多靶点、整体调节的作用特点，预测了四妙勇安汤在血管新生中的主要作用机制[15]。

加味四妙勇安油是对四妙勇安汤进行方药加减以及剂型调整而制成，根据用药经验甄选加入生黄芪、紫草、连翘、蒲公英、冰片。黄芪对机体免疫系统具有一定的调控作用，黄芪多糖干预免疫低下小鼠可提高巨噬细胞吞噬指数、吞噬率，而黄芪中黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗病毒、神经保护等多种药理作用[16]。紫草具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[17]，其主要成分紫草素可通过调控血液氧化还原稳态，缓解血热证小鼠高热、出血瘀血、血液氧化损伤，从而发挥清热凉血作用[18]。有网络药理学研究发现黄芪-紫草药对可以通过多成分多靶点发挥抑制炎症反应、抗细胞凋亡、促进细胞增殖及血管生成、免疫调节等作用[19]。连翘善清热解毒、消痈散结，被誉为“疮家圣药”，如《神农本草经》中描述连翘“主寒热，鼠痿，瘰疬，痈肿恶疮，瘿瘤，结热”。实验研究表明连翘苷可减轻炎症反应，促进肛周脓肿大鼠创面血管新生，并推测其作用机制与激活JAK2/STAT3通路有关[20]。《本草正义》中记载：“蒲公英，其性清凉，治一切疔疮、痈疡、红肿热毒诸证，可服可敷，颇有应验，而治乳痈乳疖，红肿坚块，尤为捷效。”现代药理研究发现蒲公英有抑菌、 抗氧化、抗炎、抗肿瘤、胃肠保护等作用[21]。冰片外用可清热凉血、抗炎，且冰片作为早期的天然透皮吸收促进剂可增加多种药物的透皮量[22]。

本实验结果表明，加味四妙勇安油在延缓大鼠急性放射性皮炎创面发生、减轻创面严重程度、促进创面愈合方面的效果均优于复方维生素B12溶液、生理盐水。分析原因为加味四妙勇安油直接作用于创面后对创面形成保护层，减少空气与创面的接触，减少日常污染源，预防感染，且药物有效成分经皮肤组织充分吸收，从而起到预防、延缓创面发生、发展的作用。本实验结果进一步为加味四妙勇安油的临床应用提供了客观依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。