KMT2A-USP2融合基因阳性婴儿白血病1例并文献复习

邹品力，廖 欣，肖剑文

(重庆医科大学附属儿童医院血液科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

KMT2A基因重排，既往也称为混合系白血病(MLL)基因重排，在婴儿急性淋巴细胞白血病(ALL)中十分常见，约占75%。KMT2A基因位于目前已发现的KMT2A基因重排已有超过120例[1]。尽管KMT2A基因重排的转录本的预后与其伴侣基因相关，但目前报道的绝大部分KMT2A重排阳性患儿预后较差[1-3]。既往临床上检测KMT2A基因重排主要通过荧光原位杂交技术(FISH)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，但仅可检出常见的KMT2A重排方式，不能覆盖罕见的KMT2A重排方式。目前国际上KMT2A-USP2已报道的例数不足30例，且绝大多数均以个案为报道[4-8]，国内鲜见报道。本文通过报道1例KMT2A-USP2融合基因阳性ALL患儿，并复习相关文献，探讨KMT2A-USP2融合基因阳性ALL患儿的临床特点及预后情况，探究二代测序技术在ALL患儿中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 患儿，男，8个月，病初因“皮肤瘀斑10 d，发热半天余”入院，查体：轻度贫血貌，皮肤可见散在瘀斑，淋巴结不大，肝脏肋下剑突下2 cm触及，脾肋下未及。辅助检查：初诊血常规：血红蛋白94 g/L，血小板计数 31×109L-1，白细胞计数 175.87×109L-1，原始幼稚淋巴细胞比例73%。骨髓细胞学结果提示为ALL L1型(图1)。通过流式细胞学技术(FCM)检出的免疫分型结果提示B淋系抗原CD19、cCD79a、CD34、CD38及HLA-DR阳性，考虑为Pro-B ALL。通过FCM检测到微小残留病(MRD)标志，可用于MRD检测。FISH检测ETV6-RUNX1、BCR-ABL1、TCF3-PBX1、MYC及KMT2A断裂探针示阴性，其操作方式参考文献[9]。使用多重巢式RT-PCR技术检测29种融合基因转录本[10]，结果示阴性。

A.骨髓涂片(瑞士染色)；B.细胞化学染色(POX染色)。

1.2方法

1.2.1全外显子组测序 肝素抗凝管采集患儿骨髓液2 mL，并从患儿口腔黏膜及其父母外周血中采集对照样本。使用DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood MiniKit，Qiagen)从患儿骨髓液中提取基因组 DNA，操作方案按照试剂盒说明书，通过捕获试剂盒(Agilent SureSelect Human All Exon V6)进行序列采集，纯化后进行序列扩增。采用高通量测序仪(Illumina hiseq PE 150bp)对扩增产物进行测序。最后使用高通量测序仪(Illumina HiSeq X10)进行测序，测序模式选用PE150。利用Illumina pipeline软件(1.3.4版)读取原始测序数据，并参照dbSNP 数据库、ClinVar数据库、ESP6500数据库、ExAc数据库、HGMD数据库、千人基因组数据库及Ensembl数据库等进行分析。利用GATK、LRT、Mutation Taster及SamTools软件预测突变基因，并用测序工具(http://sift.icvi.org/)及Polyphen网站 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph) 对蛋白质功能进行预测。

1.2.2转录组测序 取1.5 mL新鲜骨髓液样本，使用RNA提取试剂盒(QIAamp RNA Blood MiniKit，Qiagen，Cat.52304)进行总RNA的提取，操作步骤参照该试剂盒说明书进行。然后使用建库试剂盒(KAPA mRNA HyperPrep Kit，KAPA/Roche，Cat.KK8581)进行mRNA-seq建库，最后使用高通量测序仪(Illumina HiSeq X10)进行测序，测序模式选用PE150。用BWA软件将测序片段与人类参考基因组(UCSC-hg19)进行比较，去除重复序列，用Picard软件分析下游数据。使用GATK软件预测基因突变，使用Seeksv软件预测融合基因。

1.2.3致病突变与融合基因分析 参考美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)、分子病理学协会(AMP)及美国病理学家学院(CAP)的指南[11]建议分析骨髓标本中的致病基因突变和融合基因。通过参考文献[11]和软件分析将发现的变异分为以下几类：致病性、可能致病性、不确定意义、可能良性和良性。将致病基因型和可能致病基因型记录为致病基因突变。检出的致病基因突变，使用Sanger法验证其PCR产物，同时交叉检测其对照样本。检出的融合基因，通过设计引物，使用RT-PCR进行验证。

1.2.4治疗方法 确诊后该患儿在St Jude Total XV ALL方案基础上采用改良的CCCG-ALL-2015方案进行化疗。因患儿年龄<1岁，初诊白细胞>50%，初步评估为中危组。

2 结 果

尽管通过FISH提示KMT2A断裂探针阴性且RT-PCR技术检测到常见的KMT2A重排阴性，但因其为婴儿，同时诱导缓解治疗反应差，故仍怀疑其存在KMT2A基因重排。WES检测(图2)出ATM、CASC5、LPP(来源于母亲)和PDGFRB(来源于父亲)的致病基因突变，并通过Sanger测序法证实。RNAseq检测出USP2-NARS2、KMT2A-USP2和c15orf57-CBX3的融合转录物。通过设计Sanger测序和RT-PCR的特异性引物，排除了C15orf57-CBX3的融合转录本和KMT2A-USP2-NARS2的可疑融合转录本，证实了USP2-NARS2和KMT2A-USP2的融合转录本(图3、4)。在USP2-NARS2融合中，5′端USP2基因的2号内含子与3′端NARS2基因的2号外显子融合，5′端USP2基因的2号外显子也与3′端NARS2基因的2号外显子融合。在KMT2A-USP2融合中，5′端KMT2A基因的22号外显子与3′端USP2基因的3号外显子融合。

1.分子量标记物；2.融合转录本USP2-NARS2；3.融合转录本KMT2A-USP2；4.PCR质控。

确诊后患儿予以CCCG-ALL-2015方案中危组化疗，诱导缓解第19天(D19)骨髓细胞学：增生极度降低，幼稚淋巴细胞占1%；骨髓MRD占14.87%。D50骨髓细胞学：原始幼稚淋巴细胞占15%；骨髓MRD占0.49%。CAT2前骨髓细胞学：幼稚淋巴细胞占8.5%；骨髓MRD占0.35%。因患儿D50及CAT2前骨髓细胞学持续处于M2状态，MRD未缓解，调整危险度为高危。2019年1月10日间期前复查骨髓细胞学：原始幼稚淋巴细胞占10%；骨髓MRD<0.01%。2019年5月8日再诱导前复查骨髓细胞学：幼稚淋巴细胞占3%；骨髓MRD<0.01%。2019年5月23日再诱导期间复查骨髓细胞学：原始幼稚淋巴细胞占15%。2019年6月8日维持治疗前复查骨髓细胞学：幼稚淋巴细胞占4.5%；骨髓MRD<0.01%。最近1次于2020年6月17日维持期复查骨髓细胞学：幼稚淋巴细胞占3%。目前该患儿已完成DEX+VDLP、CAT、CAT2、第1～4次HD-MTX巩固、间期1～16周期化疗再诱导、维持治疗(一)1～5循环、维持治疗(二)1～7循环，现维持治疗(三)阶段；期间按计划行腰穿及鞘注，脑脊液检查均无中枢浸润依据。化疗期间因反应差考虑行异基因造血干细胞移植，但未找到合适供者，遂被搁置。截至随访时间，患儿已获得完全缓解(CR)共25个月。

A.致病突变ATM；B.致病突变CASC5；C.致病突变LPP；D.致病突变PDGFRB。

图2 WES测序结果

A.USP2-NARS2；B.KMT2A-USP2。

3 讨 论

婴儿白血病是指发生于12月龄内的白血病，其特点是ALL和急性粒细胞白血病(AML)分布相对均等，婴儿ALL通常为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)，而罕见急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)[12]。KMT2A重排在儿童B-ALL人群中发生率不足2%，但在大约75%的婴儿B-ALL中出现[12]。KMT2A基因(OMIM：159555)，全名为赖氨酸甲基转移酶2A，既往也称为MLL基因[3]，位于11号染色体q23.3。该基因编码一个转录共激活因子，在早期发育和造血过程中起到调节基因表达的重要作用[12]。KMT2A基因重排涉及多种伴侣基因，其转录物编码的特异性蛋白质是ALL发生的确切病因。在AML和混合表型急性白血病(MPAL)中也可检测到KMT2A重排，其阳性率分别约为60%、15%[1,3,12]。KMT2A-r基因有120多种相关转录子亚型。因此，临床医生很难用RT-PCR检测如此庞大的转录本。KTMT2A常见的伴侣基因包括AF4、AF6、AF9、ENL等[1]。

本研究通过RNA-seq发现1例婴儿B-ALL合并KMT2A-USP2，并在该患儿中发现了USP2-NARS2融合转录本，该转录本既往被发现于贲门腺癌而非白血病中[13]。USP2基因(OMIM：604725)位于编码泛素羧基末端水解酶2，参与调节细胞内蛋白水解、细胞周期调节和应激反应[14]。NARS2基因(OMIM：612803)编码氨酰tRNA合成酶并在氧化磷酸化中发挥作用[15]。目前尚无研究证明KMT2A-USP2在白血病的发生、发展中的作用，猜测USP2基因作为伴侣基因调控KMT2A基因的功能，但仍需要进一步的研究来证实这项假设。

自从报道了第一例KMT2A-USP2以来，目前通过二代测序技术共发现24例白血病合并KMT2A-USP2融合基因阳性，其中AML 2例、MPAL 8例、B-ALL 14例[4,7]。迄今为止，MEYER等[7]的研究中KMT2A-USP2重排的婴儿和儿童白血病的例数最多，其包括了17例患者(8例男性和9例女性)，初诊中位年龄为17个月。免疫分型主要为B-ALL(12例)，其次为MPAL(4例)，病初多表现为白细胞增多，易合并中枢神经系统受累(4例)，治疗反应差，预后差，与本研究中患儿相符。MEYER等[7,16]的研究中发现>95%的KMT2A重排中，KMT2A断裂点位于其第8～14号外显子，且明显趋向于第9～12号外显子，其中包括了最常见的KMT2A重排类型，并将其命名为主要断裂点区域，而除此之外，还发现了另一个次要断裂点区域，位于第19号内含子到24号外显子，且明显趋向于第21～23号内含子之间，大量新发现的KMT2A重排断裂点发生于此，其中KMT2A-USP2均发现于次要断裂点区域，本研究中患儿KMT2A的断裂点位于22号外显子。

尽管KMT2A-USP2融合基因十分罕见，但近年研究表明其可能仍有大量未被发现的KMT2A-USP2案例。MEYER等[7]通过设计2 688个覆盖于整个KMT2A基因的捕获探针并使用Illumina平台测序，这种方式发现了之前各种常规筛查阴性的KMT2A-USP2融合，同时还发现了另外尚未被报道的KMT2A-USP8重排，这种具有靶向的NGS技术更能发现发生于次要断裂区的KMT2A重排。

总之，KMT2A重排在婴儿白血病中阳性率高，但常规检测手段如FISH、RT-PCR技术只能发现常见的KMT2A重排，对于常规检测为阴性的婴儿白血病，需警惕合并罕见KMT2A重排，当怀疑存在KMT2A重排时，应当完善转录组测序或其他二代测序手段以明确。靶向覆盖KMT2A基因的二代测序技术在婴儿白血病中使用可更好地区分其危险度。KMT2A-USP2重排阳性患儿的治疗反应差，应当加强化疗强度以达到MRD，有条件者可予以造血干细胞移植。