SH2B1对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响和机制研究

毛帅，王顺，颜辉，杨曼琪，吴钢

心肌肥厚是心脏应对压力超负荷等各种刺激发生的一种适应性反应，表现为心肌细胞面积增大、间质增殖、血管生成增多、心室壁变厚等。心肌肥厚分为2种类型：妊娠、运动等引起生理性心肌肥厚，在刺激消失后往往会逆转；而心肌梗死、高血压等常导致病理性心肌肥厚,长期持续的病理性刺激会发生不良的后果，如心律失常、心力衰竭和心源性猝死等[1]。因此，如何干预病理性心肌肥厚并延缓病情的进程成为研究的重点。

研究发现，在病理性心肌肥厚过程中，会发生所谓的“能量代谢重编程”[2]。即在正常情况下，心脏的能量来源70%～90%来自脂肪酸，然而病理性心肌肥厚后期甚至心力衰竭时，心脏主要利用糖酵解途径供能[3]。同源性2b衔接蛋白1(Src homology 2 binding protein 1, SH2B1) 属于SH2B家族，是含有SH2和PH结构域的接头蛋白，编码的蛋白质介导各种激酶的激活，并可能在细胞因子和生长因子受体信号传导以及细胞转化中起作用，其缺失会导致严重的肥胖及瘦素、胰岛素抵抗[4-5]。已有研究证实SH2B1与糖尿病患者心肌梗死、冠心病发生率密切相关。然而，关于其在病理性心肌肥厚中扮演的角色以及发挥作用的主要机制目前尚不清楚。现观察在AngⅡ诱导心肌肥大过程中，SH2B1对心肌细胞糖代谢的影响，探讨相关机制，为心肌肥厚的临床治疗提供新的治疗靶标，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)原代大鼠：新生1～3 d乳鼠，雌雄不限，购于湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：42000600016516。(2)试剂试药：抗体SH2B1(R&D Systems)，AMPK、p-AMPK、G6PD、GAPDH及HRP标记的山羊抗兔IgG均购自Cell Signaling Technology ，TRIzol均购自invitrogen，cDNA合成试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix均购自Roche，RIPA裂解液均购自碧云天，BCA蛋白定量试剂盒均购自普利莱。PVDF膜购自Millipore， DMEM均购自Gibco, Opti-MEM均购自Gibco， iMAX均购自invitrogen，AngⅡ、 AMPK抑制剂compound C均购自Sigma-Aldrich。(3)仪器设备：倒置显微镜，化学发光成像系统(Bio-Rad), 细胞培养箱，LightCyclerR 480(Roche)

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞分离和处理：2016年6月—2017年2月于武汉大学第一临床学院中心实验室进行实验。选取1～3 d新生乳大鼠，处死后取出心脏,置于预冷PBS缓冲液中清洗2～3次,修剪心脏除去多余的血管、心房；将心脏置入0.125%胰酶中稍剪开但不剪碎,再放入15 ml离心管中,加入0.125%胰酶10 ml静置, 4℃过夜 ；第2天,吸出上清液,加入含0.035%胶原酶Ⅱ的消化液 6 ml,置于37℃水浴轻轻振摇3～5 min,待液体变混浊后即停止消化,重复消化6～7次。 收集上清液离心10 min,弃上清,加入适量含10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞,接种于10 cm培养皿中进行差速贴壁1 h去除成纤维细胞,将细胞悬液接种于35 mm培养皿中,细胞密度为1×106,培养24 h后,用倒置显微镜观察。

首先，将分离培养好的乳鼠心肌细胞随机分为对照组、AngⅡ组，每3只。对照组不予任何处理，AngⅡ诱导心肌细胞肥大的方法如下：将乳鼠心室肌细胞转染后24 h，弃去旧培养基，PBS洗1次，将AngⅡ稀释于含1%双抗+1%ITS的DMEM培养基中，终浓度为1 μmol/ml。加入AngⅡ刺激24 h后，收集细胞用于实验。

为了进一步探索SH2B1在心肌肥厚中发挥的作用，将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、siSH2B1组、siSH2B1+ AngⅡ组,每3只。使用invitrogen公司的iMAX转染试剂盒转染细胞，按照使用说明书操作，以35 mm培养皿为例：铺好乳鼠心室肌细胞24 h后，转染前将完全培养基更换成含1%双抗+1%ITS的DMEM培养基。配置转染工作液，取4 μl siRNA,加入opti-MEM稀释至总体积为100 μl,室温放置。取iMAX 6 μl，加入opti-MEM稀释至总体积为100 μl，室温放置5 min。将稀释的iMAX加入稀释的siRNA中轻轻混匀，室温放置15 min。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 ml培养基中，轻轻混匀培养基，将细胞放回培养箱中继续培养24 h。接着使用AMPK抑制剂compound C处理乳鼠心肌细胞，将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+compound C组，直接向含有2 ml培养基的心肌细胞中加入用5μmol 的AMPK抑制剂compound C处理细胞，45 min后再加入1 μmol AngⅡ，将细胞放回培养箱继续培养24 h。

1.2.2 荧光定量PCR检测ANP、BNP基因表达：使用TRIzol从新鲜乳鼠心室肌细胞中提取总RNA。利用cDNA合成试剂盒合成cDNA。然后，采用SYBR Green PCR Master Mix进行荧光定量PCR，以内源性GAPDH为对照，量化目标基因的相对表达水平。用于扩增的引物序列如下：(1)心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)：5'-ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3' (上游)和5'-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(下游)； (2)脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)：5'-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3'(上游)和5'-GCAGCTTGAACTATGTGCCA-3'(下游)；(3)GAPDH：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'(上游)和5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'(下游)。

1.2.3 Western Blot法检测SH2B1、GLUT4、C6PD蛋白水平：用RIPA裂解液从新鲜乳鼠心室肌细胞中提取蛋白质，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE对每个样品中等量的蛋白质(20 μg)进行分离，然后转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，将这些膜与以下相对应的一抗在4℃下孵育过夜：AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、SH2B1(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)。然后，在室温下与一抗相应的辣根过氧化物酶结合二抗孵育2 h。后使用化学发光显影液在化学发光成像系统上曝光显示目标条带，并将目标条带用image J (National Institutes of Health)进行量化分析。以GAPDH蛋白含量作为内参进行标准化，得到每个样本中目的蛋白的相对表达水平。

2 结 果

1.1 AngⅡ诱导心肌细胞肥大过程中SH2BI表达和糖代谢改变 与对照组比较，AngⅡ组ANP、BNP mRNA表达明显升高(P<0.05)，提示心肌肥厚造模成功(图1A)。接着使用Western Blot检测AngⅡ诱导组细胞中SH2B1蛋白水平的变化，结果显示,与对照组相比，AngⅡ组SH2B1的蛋白表达水平上调(图1 B,C)，差异有统计学意义(P<0.05)。同时， Western Blot检测AngⅡ诱导组细胞中GLUT4、G6PD蛋白表达水平，结果显示, 与对照组相比，AngⅡ组GLUT4、G6PD蛋白表达水平增加(图1 D,E)，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明，在AngⅡ诱导心肌肥大过程中，SH2BI表达增加，糖代谢活动增强。

注：A.AngⅡ诱导心肌细胞肥大后ANP、BNP的mRNA相对表达水平；B、C. AngⅡ诱导心肌细胞肥大后SH2B1的电泳图及比较；D、E. AngⅡ诱导心肌细胞肥大后GLUT4、G6PD的电泳图及比较。与对照组比较，aP<0.01

1.2 AngⅡ诱导心肌细胞肥大过程中AMPK通路改变 与对照组相比，AngⅡ组AMPK基本不变，而其磷酸化增强，差异具有统计学意义(P<0.05),见图2。表明在心肌肥大的过程中AMPK信号通路被激活。

注：A. AngⅡ诱导心肌细胞肥大后AMPK、p-AMPK的电泳图；B. AMPK磷酸化水平的量化比较。与对照组比较，aP<0.01

1.3 下调SH2B1对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响 与siNeg组相比，siSH2B1 转染后其表达量明显下降(图3 B,C)，差异具有统计学意义(P<0.05)，即siSH2B1能成功敲低SH2B1的表达。与siNeg+AngⅡ组相比，siSH2BI +AngⅡ组GLUT4、G6PD蛋白表达减少(图3D,E),差异具有统计学意义(P<0.05)。表明SH2B1表达减少可抑制AngⅡ诱导心肌细胞肥大过程中的糖代谢，减少心肌肥厚程度。

注：A. 心肌细胞肥厚指标ANP、BNP的mRNA相对表达水平；B、C. 转染siRNA后SH2B1的电泳图及比较；D、E. 转染siSH2B1后GLUT4、G6PD的电泳图及比较。与对照组比较，aP<0.01; 与siNeg组比较，bP<0.05，cP<0.01

1.4 下调SH2B1对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中信号通路AMPK的影响 与siNeg+AngⅡ组相比，siSH2BI +AngⅡ组AMPK的磷酸化水平减弱(图4)，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明SH2B1表达减低可抑制AMPK信号通路的激活。

注：A. 转染siSH2B1后AMPK、p-AMPK的电泳图；B.AMPK磷酸化水平的量化比较。与对照组比较，aP<0.01; 与siNeg组比较，bP<0.01

1.5 抑制AMPK通路对AngⅡ诱导的心肌肥大过程中糖代谢的影响 与对照组相比，AngⅡ组GLUT4、G6PD蛋白表达水平上调(图5),差异具有统计学意义(P<0.05)；而与AngⅡ组相比，compound C+ AngⅡ组的GLUT4、G6PD蛋白表达减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明抑制AMPK通路可减轻AngⅡ诱导的心肌肥大过程中的糖代谢。

注：A. 糖代谢相关蛋白GLUT4、G6PD的电泳图；B. GLUT4、G6PD水平比较。与对照组比较，aP<0.05; 与AngⅡ组比较，bP<0.01

3 讨 论

作为一种接头蛋白，SH2B1在多种信号传导过程中发挥重要作用，并且可以调控能量平衡、体质量和糖代谢。以往研究重点多放在其与癌症的关系，研究发现SH2B1在多种恶性肿瘤中表达异常[6-9]。Liu等[10]研究表明SH2B1在肺癌中高表达，miR-361可以直接靶向肺癌中SH2B1从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。近年来，SH2B1在心血管疾病中的研究逐渐增多。肥胖是心血管疾病的独立危险因素，而SH2B1作为肥胖相关的基因，研究显示其基因多态性与肥胖和非酒精性脂肪肝患者的脂肪变性的严重程度密切相关[11]。Wu等[12]的研究直接揭示了SH2B1在压力超负荷下通过激活JAK2/STAT3信号通路发挥促心肌肥厚的作用。Liu等[10]发现miR-142-3p能直接作用于SH2B1来改善病理性心肌肥厚并调控线粒体功能。然而，SH2B1是否参与病理性心肌肥厚代谢重编程的发生发展目前尚不清楚。本研究证实AngⅡ刺激乳鼠心肌细胞后，与对照组相比，SH2B1的蛋白表达水平增加，推测SH2B1的高表达可能与心肌肥厚的发生发展相关。使用siRNA沉默SH2B1时，SH2B1蛋白表达量明显减少，提示siRNA转染效果好。转染siRNA48 h后，与AngⅡ组相比，siSH2B1+ AngⅡ组的心肌肥厚标志物ANP、BNP显著下降，这与既往报道一致。

在心肌肥厚进展过程中，心脏更加偏好糖酵解供能，发生能量代谢重编程[13]。一方面将葡萄糖作为底物，能量利用效率更高，另一方面，糖酵解速率提升的同时生成了更多的质子以及乳酸，而酸性环境将进一步损伤心肌细胞[14]。目前普遍认为这种心肌燃料代谢的异常促进了心肌肥厚和心力衰竭的发展[15]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AMPK被称作能量代谢的总开关，在糖代谢中发挥重要作用[16]。本研究中通过AngⅡ构建心肌细胞肥大模型，发现在心肌肥厚过程中，糖酵解活动增强，而且伴随着 “能量传感器”AMPK的活化，GLUT4、G6PD蛋白表达也上调。而在一项新的研究中，APMK的强效变构激活剂MK-8722能诱导持久的葡萄糖摄取和糖原合成，并且给药1个月后，大鼠出现心脏重量增加并观察到与心脏糖原增加相关联的心脏肥大[17]。

SH2B1作为内源性瘦素增敏剂，可增强瘦素的敏感性[18]。瘦素刺激JAK2的Tyr813位点使其自磷酸化[19]。而SH2B1通过其SH2结构域与自磷酸化Tyr813位点结合，显著增强JAK2活性，从而促进JAK2下游瘦素信号通路的激活[19]。2002年，Barbara Kahn的实验室首次阐明AMPK在介导瘦素作用中扮演的关键角色，证明在骨骼肌中瘦素激活AMPK从而调控脂肪酸代谢。而最近研究发现瘦素可以调控脂肪细胞的分化及米色脂肪转化，这依赖于APMK信号通路的激活[20]。由此笔者推测SH2B1或许可以通过调控AMPK信号通路调节能量代谢过程。在本研究中，下调SH2B1的表达后，AMPK、GLUT4、G6PD蛋白水平显著降低，提示沉默SH2B1可能抑制AMPK磷酸化，GLUT4、G6PD蛋白表达。而使用AMPK抑制剂compound C能达到与沉默SH2B1类似的效果，由此我们推测沉默SH2B1可能抑制了其对AMPK信号通路的激活作用，从而导致心肌细胞肥大过程中糖酵解活动的下降，起到心脏保护作用。

总之，本研究表明，SH2B1可以通过AMPK介导的GLUT4促进葡萄糖摄取，和G6PD促进糖酵解中间产物的分解代谢，从而增加糖酵解通量。这一研究揭示了以前从未被认识的SH2B1与心肌肥厚中能量代谢重编程之间的关系，为临床治疗病理性心肌肥厚提供新的靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

毛帅：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；王顺：完善研究方案；颜辉、杨曼琪：分析试验数据；吴钢：提供研究方向，论文审核