丹参酮ⅡA通过调控NF-κB信号通路对脓毒症大鼠血管内皮细胞的保护作用

刘旭东,冯俊,周代星,于刚

脓毒症是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍疾病[1]。有研究表明，脓毒症患者病死率高达30%～50%[2]。临床上对于脓毒症的治疗，主要采取早期抗感染治疗、液体复苏、血管活性药物应用及器官支持等手段[3-4]。近年来的研究表明，血管内皮细胞(VEC)功能障碍在脓毒症进展中处于枢纽地位[5]。脓毒症早期，内毒素作用于血管内皮细胞表面的受体，促进炎性因子大量释放，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)等。内毒素及炎性因子的大量释放，直接损伤血管内皮细胞，使其通透性增加，导致毛细血管渗漏，加重组织器官灌注不足，进而导致多器官功能障碍[6-9]。因此，改善血管内皮细胞功能对降低脓毒症的病死率至关重要，也为临床治疗脓毒症提供了新的治疗思路[10-11]。丹参酮ⅡA 是中药丹参中最主要的生物活性成分之一，已有研究表明其通过保护内皮细胞对多种心血管疾病具有保护作用[12-13]，但目前对其是否可改善脓毒症的内皮细胞损伤还不清楚。 因此，本研究旨在观察丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠血管内皮细胞的保护作用，并探讨可能机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)动物： 雄性SD大鼠36只，月龄9周，体质量 280～300 g，由湖北省实验动物研究中心提供，饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。本次动物实验符合动物伦理委员会的要求，并严格按照《中华人民共和国实验动物管理条例》和《实验动物质量管理方法》的要求进行。(2)药品与试剂：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(诺新康，上海第一生化药业有限公司生产)；NF-κB激活—核转运检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司生产)；ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产)；TUNEL检测试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司生产)。(3) 仪器设备： 荧光显微镜(UFM3201型，深圳盛天仪器有限公司生产)；冰箱(BL-200SM200L型，南京中大天晴仪器有限公司生产)；电泳仪(EPS-300型，上海天能科技有限公司生产)。

1.2 实验方法 实验于2019年1—12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院进行。(1) 分组：健康雄性SD大鼠36只随机数字表法分为假手术+生理盐水(NS)组(对照组)，盲肠结扎穿孔术(CLP)+NS组(脓毒症组)，CLP+丹参酮ⅡA磺酸钠注射液组(丹参酮ⅡA干预组)，每组12只。(2)模型制备：大鼠术前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg),充分麻醉后置于仰卧位并固定,消毒腹部皮肤,于中下腹部做纵切口3 cm,打开腹腔,钝性分离及游离以充分暴露盲肠，脓毒症组和丹参酮ⅡA干预组于距盲肠末端 1 cm处采用3号缝合线环形结扎,保证肠道通畅,并据结扎处5 mm位置采用9号针头贯穿盲肠2次，并轻挤压确保粪便溢出，并进行后续的关闭腹腔手术；对照组仅做盲肠探查术。丹参酮ⅡA干预组术前2 h通过尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20 mg/kg)，对照组及脓毒症组术前2 h通过尾静脉注射同等量的0.9%氯化钠注射液。(3)标本收集与保存：造模24 h后，颈椎脱臼处死大鼠，取大鼠外周血管组织，采用4%中性甲醛固定外周血管组织，24 h后采用梯度酒精脱水处理，对外周血管组织进行石蜡包埋后切成5 μm 的病理组织切片，取外周血管组织立刻放入液氮罐冷冻后-80℃冰箱保存待测。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血管内皮细胞NF-κB表达检测： 先取外周血管病理组织切片进行常规脱蜡及水化处理，然后根据NF-κB激活—核转运检测试剂盒的使用说明书，并参照Linghu等[4]使用的方法对组织切片进行免疫荧光染色，用荧光显微镜观察染色情况。本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。

1.3.2 血管内皮细胞凋亡及促凋亡基因 Caspase-3蛋白水平检测：(1)细胞凋亡检测，采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)，具体操作严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。凋亡细胞核被染成棕黄色，未凋亡细胞核为深蓝色。(2) 促凋亡基因 Caspase-3的蛋白水平检测，采用Western-blot法，具体步骤见文献[5]的报道，将提取好的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸后，进行10%SDS-PAGE电泳，采用半干转进行蛋白转膜，根据要求加入Caspase-3的抗孵育过夜，待完成二抗孵育后进行ECL显示处理，将数据进行Gel-Pro analyzer分析光密度， 最终结果以Caspase-3和 β-actin 的光密度比值表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠血管内皮细胞NF-κB表达比较 采用免疫荧光染色后，荧光显微镜下NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。血管内皮细胞浆及细胞核内出现红色颗粒染色即为表达NF-κB，正常血管内皮细胞(对照组)几乎不或弱表达NF-κB。与对照组(1.32±0.56)比较，脓毒症组(43.25±4.33)血管内皮细胞浆和细胞核均显示不同程度的红色颗粒染色，且血管内皮细胞中NF-κB平均光密度值均明显高于对照组(t/P=213.158/0.000)；而丹参酮ⅡA干预组(20.74±5.28)NF-κB平均光密度值明显低于脓毒症组(t/P=116.995/0.000)，见图1。

图1 各组大鼠血管内皮细胞NF-κB表达比较(HE染色，×100)

2.2 各组大鼠血管内皮细胞凋亡比较 荧光显微镜下观察，对照组细胞核呈圆形或椭圆形，荧光分布均匀。与对照组比较，脓毒症组内皮细胞出现典型的细胞凋亡形态，胞核固缩，致密深染，染色质边集，细胞质内可见亮蓝色强荧光；与脓毒症组比较，丹参酮ⅡA干预组细胞凋亡程度减轻，见图2。

图2 各组大鼠血管内皮细胞凋亡情况比较

2.3 各组大鼠血管内皮细胞Caspase-3凋亡蛋白表达比较 与对照组(0.25±0.01)比较，脓毒症组血管内皮细胞Caspase-3表达水平(0.57±0.05)明显增加(t/P=20.086/0.000)；与脓毒症组比较，丹参酮ⅡA干预组血管内皮细胞Caspase-3表达水平(0.30±0.25)明显降低(t/P=24.576/0.000)。

3 讨 论

脓毒症是一种临床综合征，定义为对感染的全身反应，其特征是器官功能障碍和休克[1]。脓毒症和随后出现的多器官功能衰竭仍然是重症监护病房发病和死亡的主要原因。脓毒症时，血管内皮是病原体及其毒素的关键宿主靶点，血液中的脂多糖(LPS)及大量炎性因子刺激血管内皮细胞，导致内皮细胞损伤[6]。脓毒症导致的内皮细胞损伤可具体表现为：引起内皮细胞通透性增加，导致血管渗漏，周围组织水肿，局部组织器官循环不足，进而导致器官功能障碍[7]。有研究表明，LPS可诱导内皮细胞程序性死亡(凋亡)，抑制内皮细胞的凋亡可改善内皮细胞损伤[8]。本研究结果显示，脓毒症组内皮细胞出现典型的细胞凋亡形态，且脓毒症组血管内皮细胞Caspase-3等凋亡蛋白表达水平增高，提示脓毒症可诱导内皮细胞凋亡。本研究结果与多项动物实验结果类似[9-11]。

丹参酮ⅡA是中药丹参的脂溶性有效成分,因其特殊的药理作用，包括舒张血管、抗凝、抗炎、清除自由基等，在我国被广泛用于治疗与循环系统紊乱有关的疾病[12]。动物实验表明，丹参酮对脓毒症大鼠小肠具有保护作用，其机制可能与抑制肠上皮细胞凋亡和减少炎性细胞因子的活化有关[13]。本研究结果显示，丹参酮ⅡA干预组细胞凋亡程度减轻，且血管内皮细胞Caspase-3凋亡蛋白表达水平降低，提示丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠血管内皮细胞起到保护作用，其机制可能与丹参酮可抑制内皮细胞凋亡有关。

核因子-κB参与许多免疫调节介质的转录，这些免疫调节介质参与了脓毒症诱导的器官衰竭发展[14]。在脓毒症模型中，抑制NF-κB的激活可以减少急性炎性反应过程和器官功能障碍。Huang等[15]实验研究表明，抑制NF-κB信号通路可以保护肺微血管内皮细胞免受LPS诱导的凋亡；Kurpios-Piec等[16]的研究也表明，激活NF-κB可促进炎性反应，并引起内皮细胞的损伤。由此可见，NF-κB相关因子极可能介导了炎性反应诱导的内皮细胞损害，减少NF-κB信号通路的激活对血管内皮细胞的保护至关重要。本研究发现，脓毒症大鼠血管内皮细胞NF-κB平均光密度值明显升高，而丹参酮ⅡA处理后NF-κB平均光密度值明显降低。上述结果表明，脓毒症可激活NF-κB信号通路，诱导内皮细胞凋亡，并进一步引起内皮细胞损伤；而丹参酮ⅡA干预后可抑制NF-κB信号通路的激活，起到保护内皮细胞的作用。

综上所述,丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠血管内皮细胞具有保护作用，这可能与抑制NF-κB信号传导通路进而抑制内皮细胞凋亡有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘旭东：实施研究过程及论文撰写；冯俊、周代星：实验指导，论文修改及论文审核；于刚：提出研究思路，设计研究方案，分析实验数据