基于PI3K/AKT通路探究沉默TRAF6对柯萨奇病毒性心肌炎模型小鼠的干预效果

唐智奇，杨帆，卢东东，杨梅，苗林，方迪海

心肌炎属于临床常见心血管疾病，主要由细菌、病毒、真菌感染或药物、毒素、全身性疾病、自身免疫失调引发。病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由多种嗜心肌病毒引发的心肌非特异性炎性反应[1-2]。据流行病学调查显示， VMC发病率占心肌炎绝大部分，肠道病毒、柯萨奇病毒感染引起的VMC占50%以上。近年来，受社会发展、环境变化等因素影响，其发病率呈逐年上升趋势，以无明显症状的心肌局灶性炎性反应为唯一的临床表现，若未及时接受有效治疗，则会出现心律失常、心源性休克甚至猝死等表现，对患者生命健康造成严重威胁[3-4]。目前，VMC发病机制尚未完全阐明，且目前临床上仍缺乏有效治疗手段及药物[5]。为寻求安全有效的治疗方法，现建立VMC小鼠模型，通过PI3K/AKT通路分析沉默肿瘤坏死因子受体相关分子6(TRAF6)对VMC模型小鼠的干预效果，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1) 动物：选取健康雄性SD小鼠44只，由南京君科生物工程有限公司提供。月龄6～9(7.5±1.3)月，体质量187～219(203.0±13.6)g。饲养环境保持温度(23.1±1.6)℃，相对湿度45%～55%，12 h昼夜交替照明饲养1周。给予标准鼠科动物饲料，不限制饮水、饮食。本研究获得医院伦理委员会批准。(2)试药试剂：柯萨奇病毒(CBV)已在Hela细胞上传代并反复冻融3次后测定半数组织感染剂量为10-3/L；柯萨奇病毒3(CVB3)、总DNA提取试剂盒(伯信生物公司)，ago TRAF、antagoTRAF(上海恒斐生物科技有限公司)；(3)仪器设备：显微镜(上海永科光学仪器有限公司生产， YKJ-660型)；超声心动图仪(上海寰熙医疗器械有限公司，BK flex Focus 1202 )；荧光定量PCR仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，Applied BiOSystems]。

1.2 实验方法

1.2.1 VMC动物模型建立：2019年9月—2020年9月于广西柳州市工人医院实验室进行实验，随机数字表法抽取SD健康小鼠11只不做处理作为正常组。其余小鼠33只建立VMC模型，测定CVB3滴度后，按照剂量经腹腔注射病毒稀释液0.2 ml， 1次/d，连续注射3 d。建模过程中死亡5只，成功28只，将建模成功小鼠随机分为模型组9只，上调组9只，沉默组10只。上调组小鼠尾部静脉注射agoTRAF 630 mg/kg，沉默组小鼠尾部静脉注射antagoTRAF 630 mg/kg，正常组、模型组小鼠尾部静脉注射等剂量0.9%氯化钠溶液进行干预。

1.2.2 标本采集及HE染色：所有小鼠干预1周后取静脉血3 ml，离心获取上层血清，置于-70℃环境下保存。最后一次干预后24 h后断头处死小鼠，分离心脏取心肌组织行常规石蜡包埋及3 μm连续切片。切片烤干后行脱蜡处理，后顺序置于不同浓度酒精中复水3 min；苏木精染色15 min后清洗3次，盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗后以1%伊红染色，使用酒精脱水处理后脱蜡包埋，封片后于显微镜下观察。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 小鼠心功能检查：小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，胸部备皮，呈左侧卧位，以超声心动图采用标准胸骨旁左心室长轴及短轴二维切面，监测左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)，并计算左心室射血分数(LVEF)。

1.3.2 小鼠血清CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平检测：采用酶联免疫吸附法检测。将血清置于室温后，标记酶标板，制作标准品，然后取出试剂盒，以1∶2稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测血清和标准品100 μl/孔，放置37 ℃恒温孵育箱中湿育2 h；然后用专用洗涤液将反应板清洗3次后，再加入抗体工作液(1∶100稀释)100 μl/孔，放于37 ℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cTnT)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)溶液100 μl /孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min后在反应孔内加入终止液100 μl /孔终止反应，于酶标测试仪(美国Bio-Tek公司)450 nm处读数，计算CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平。

1.3.3 小鼠心肌PI3K、AKT蛋白表达：采用Western-blot法检测。取出小鼠待检心肌组织，用蛋白裂解液及裂解细胞低温离心后取上清，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入蛋白50 μg，在100℃环境中蛋白变性5 min。凝胶电泳、转膜/取膜，置于5%脱脂牛奶中固定、封闭处理1 h，将一抗使用0.05%～0.1% TBST稀释(PPAR-γ、NFAT-4一抗为1∶1 000)，4 ℃过夜孵育保存，后使用0.05%～0.1% TBST重复洗膜3次，5 min/次，二抗0.05%～0.1% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育 1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理5 min。DAB显色，定量分析蛋白表达情况。

1.3.4 小鼠心肌TRAF6 mRNA基因表达检测：使用RT-PCR检测TRAF6 mRNA表达。取出待检心肌组织，提取心肌组织中 TRAF6细胞总RNA，对其纯度、含量进行检测，随后逆转录获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，引物序列如下，上游引物：5＇-GCCGAAATGGAAGCACAG-3＇；下游引物：5＇-GGGCTATGGATGACAACAGG-3＇，内参U6。设置反转录反应条件：25℃ 10 min,40 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min；扩增条件:94 ℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35个循环，采用2-△△Ct方法计算TRAF6 mRNA表达量。

2 结 果

2.1 各组小鼠心肌组织病理比较 正常组心肌纤维排列整齐，细胞间隙清晰；模型组心肌纤维排列紊乱，部分间质纤维化伴断裂，局灶性炎性细胞浸润；上调组心肌细胞排列紊乱、稀疏，间质纤维化，部分出现断裂，局灶性炎性细胞浸润；沉默组心肌纤维排列整齐，部分断裂，细胞间隙正常，见图1。

图1 各组小鼠心肌组织病理变化(HE染色，×400)

2.2 各组小鼠心功能比较 与正常组比较，模型组LVESD、LVEDD升高，LVEF降低(P<0.05)；与模型组比较，上调组LVESD、LVEDD升高，LVEF降低(P<0.05)，沉默组LVESD、LVEDD降低，LVEF升高； 与上调组比较， 沉默组LVESD、LVEDD降低，LVEF升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠心功能指标比较

2.3 各组小鼠心肌损伤标志物水平比较 与正常组比较，模型组小鼠CK-MB、cTnT水平升高(P<0.05)；与模型组比较，上调组CK-MB、cTnT水平升高(P<0.05)，沉默组CK-MB、cTnT水平降低；与上调组比较，沉默组CK-MB、cTnT水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠心肌损伤标志物水平比较

2.4 各组小鼠血清炎性因子水平比较 与正常组比较，模型组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05)；与模型组比较，上调组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05)，沉默组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低；与上调组比较，沉默组CK-MB、cTnT水平降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠血清炎性因子水平比较

2.5 各组小鼠血清氧化应激指标水平比较 与正常组比较，模型组SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；与模型组比较，上调组SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)，沉默组SOD水平升高，MDA水平降低；与上调组比较，沉默组SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组小鼠血清氧化应激水平比较

2.6 各组小鼠心肌PI3K、AKT蛋白和TRAF6 mRNA表达比较 与正常组比较，模型组PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表达升高 (P<0.05)；与模型组比较，上调组PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表达升高，沉默组PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表达降低(P<0.05)；与上调组比较，沉默组PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表达降低 (P<0.05)，见表5、图2。

表5 各组小鼠PI3K、AKT蛋白和TRAF6 mRNA表达比较

图2 各组小鼠PI3K、AKT蛋白表达比较

3 讨 论

VMC作为临床常见心血管疾病，病理改变以病毒感染所致心肌细胞变性坏死、间质炎性细胞浸润等为主，进而引发不同程度心功能障碍及全身症状[6]。据流行病学数据显示，在病毒流行感染期间，约有5%患者患有心肌炎，以不同程度的发热、咳嗽、全身酸痛等症状为主要临床表现，也有少数患者出现心力衰竭、心源性休克、猝死等，对患者生命安全造成严重威胁[7-8]。相关资料显示，多种病毒均会导致心肌炎的发生，常见病毒包括肠道病毒、脊髓灰质炎病毒及柯萨奇病毒等。临床证实柯萨奇病毒感染是导致VMC患者突发心脏病并致死的主要原因[9-10]。

相关研究显示，CVB3作为最重要的病原体，在进入机体后其快速复制导致病毒血症发生，进而对心肌间质造成损伤，导致炎性因子大量释放，促进病情发展。目前，VMC发病机制尚不清楚，相关研究显示，病毒侵入刺激的免疫反应在VMC发生发展过程中发挥重要作用[11-12]。通过对小鼠VMC模型研究发现，心肌细胞表面具有特异性CVB3受体，接种CVB3病毒后心肌炎发生可达100%；另有研究显示，在小鼠注射CVB3病毒后，其心肌组织发生明显炎性浸润反应[13-14]。

当心肌损伤发生后胞浆中游离的心肌损伤标志物呈现异常表达。CK-MB、cTnT是临床常见心肌损伤标志物。相关研究显示，在心肌损伤后CK-MB、cTnT迅速升高至原水平的5～10倍，具有极高的敏感度，在临床VMC诊断中对其水平检测具有重要意义[15-16]。

相关研究显示，心肌炎病变的发生发展与炎性因子水平具有密切联系，炎性细胞浸润及心肌损伤是VMC主要病理特点[17-19]。临床常见炎性因子包括IL-6、TNF-α、IFN-γ，在VMC感染初期IL-6水平呈快速上升，产生防御作用。同时，在VMC感染初期TNF-α可被病毒识别作为抗原激活巨噬细胞，高表达TNF-α通过作用相关蛋白导致心肌损伤[20-21]。相关资料显示，正常心肌组织代谢会产生SOD活性氧，在心肌组织受到病毒攻击时大量氧自由基生成，进而消耗SOD清除自由基，使机体内SOD水平降低。同时细胞中氧化自由基数量升高，与不饱和脂肪酸结合生产MDA。由此认定通过对SOD、MDA水平检测能够有效反映细胞损伤程度[22]。

相关研究显示，TRAF6表达具有一定变化规律，且TRAF6 mRNA和蛋白表达与心肌病变病理呈显著正相关。另有研究显示，在健康小鼠心肌组织中TRF6 mRNA蛋白表达量较少，可能通过ERK、PI3K、P38MAPK等信号通路，与生存、分化、增殖及凋亡等多种生物学过程具有密切联系。由此证明在VMC发生发展中TRAF6参与其中，并在CVB3致VMC发病机制中发挥重要作用[23-24]。

综上所述，通过PI3K/AKT通路沉默TRAF6对柯萨奇VMC模型小鼠进行干预，可有效降低炎性反应，减轻心肌损伤程度及提高心功能,为临床治疗柯萨奇VMC提供参考依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

唐智奇、杨帆、卢东东：设计研究方案、实施研究过程，论文撰写；杨梅、苗林：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；方迪海：进行统计学分析