实时荧光PCR 法检测结核杆菌的临床价值

魏进武，廖俐雅，余登琼，吴朝菊，袁世梅

重庆市垫江县人民医院检验科，重庆 408300

结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，是全球需要面对的重要公共卫生问题，也是我国重点控制的重大疾病之一。我国是全球30 个结核病高负担国家之一，位居全球第2 位[1]。每年新报告肺结核患者约80 余万例，位居甲乙类传染病第2 位[2]，结核杆菌是引发肺结核的主要病原菌，该菌的细胞壁结构较为特殊，具有较强的耐药性，能够抵抗多种药物，形成耐药性的机制较为复杂[3]。这种病菌能够侵犯全身的器官，其中最为常见的就是肺部受到侵害，进而形成肺结核。肺结核是一种具有较强传染性的传染性疾病，并且能够通过空气进行传播。实验室病原学检查是诊断结核病的主要手段。肺结核主要是通过药物治疗，如果患者化疗无效、多重耐药的厚壁空洞、大块干酪灶结核性脓胸、支气管胸膜瘘、大咯血保守治疗无效，需要进行肺结核外科手术治疗[4]。针对肺结核，还应做到早发现、早诊断、早治疗，改善预后，促进患者病情好转。该次研究方便选取2018 年1 月—2020 年9 月该院门诊和住院部接收的疑似肺结核患者作为研究对象，应用涂片法、QT-PCR 法、固体培养法进行结核分枝杆菌检测，并比较三者的优异性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取该院门诊和住院部接收的疑似肺结核的患者作为该次的研究对象，其中男性3 728 例，女性3 338例。纳入标准：具有咳嗽、咳痰、低热、盗汗、痰中带血等症状或已诊断肺结核患者的密切接触者的患者，且近1个月未进行抗结核治疗，同意参与该次研究。排除标准：近1 个月进行抗结核治疗。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 抗酸染色液：冷染法；结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒（QT-PCR 法）和核酸提取试剂（磁珠法）；核酸提取仪（型号：Lab-Aid808），PCR 荧光定量分析仪（型号：宏石SLAN-48P）；罗氏培养基。

1.2.2 检验方法 严格按照《全国临床检验操作规程》、商品试剂盒说明书及仪器标准进行操作。

①标本采集和处理：患者清晨起床后首先给予清水漱口，用力咳痰置于无菌痰杯中，立即送检。涂片法连续3 d 留清晨痰液。

②固体培养法（56 例）：视样本黏稠程度，加1～2 倍4% NaOH，震荡使样本液化，取液化后的标本0.1～0.3 mL，以无菌操作接种于罗氏培养基斜面上，置培养箱中37℃孵育。7 d 后有菌落生长，报固体培养法结核杆菌阳性。若8 周内未生成菌落，则报告阴性。

③痰涂片镜检（7 066 例）：取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分0.05 mL，在玻片正面均匀涂抹成10 mm×20 mm 的卵圆形痰膜，厚度为透过痰膜看报纸上的5号字时字迹较模糊为适宜，室温中干燥后加热固定，后加入石碳酸复红染液室温染色10 min，水洗后使用3%的盐酸酒精脱色，再使用亚甲基蓝复染0.5～1 min，水洗后等待自然干燥，最后放置在显微镜下查看。若淡蓝色背景下可见红色略带弯曲的杆菌，且有分枝生长态势即为阳性[5]。

④QT-PCR 法检测（942 例）：用1～2 倍体积的4%NaOH 溶液液化痰样本，上机提取核酸，将提取好的核酸取30 μl 加入扩增管（扩增管中已预置反应体系），震荡混匀并瞬时离心后进行扩增。反应条件设置：UNG 处理50℃2 min，预变性95℃10 min ；Touchdown 循环程序：95℃10 s，71℃15 s（每个循环下降1℃），78℃15 s，循环10 次；PCR 循环程序：95℃10 s、61℃15 s、78℃15 s，循环45 次。每批次实验设置阴阳对照及临界水平对照，扩增结束按试剂盒说明书要求分析结果，结果有效且样本Ct 值≤25 判断结果为阳性。

1.3 观察指标

观察3 组患者抗酸杆菌阳性检出率。对比涂片法与QT-PCR 法抗酸杆菌阳性检出率、特异性、灵敏度、准确率。特异性=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100.00%；灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性人数）×100.00%；准确率=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100.00%。

1.4 统计方法

采用SPSS 26.0 统计学软件对所有数据结果进行统计分析。满足正态性检验与方差齐性检验的计量资料以（）表示，多组样本间差异比较采用单因素方差分析，如有显著性差异，组间两两比较用LSD 法检验；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，均作双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者纳入对象一般资料比较

3 组患者的性别、年龄、病程3 项一般资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 3 组患者一般资料比较

2.2 3 组患者固体培养法抗酸杆菌阳性检出率比较

共有561 例应用固体培养法检测，其结核杆菌的阳性例数为205 例，阳性率为36.54%。固体培养法将作为结核杆菌检出的金标准。典型的结核杆菌菌落呈菜花状，见图1、图2。

图1

图2

2.3 3 组患者涂片法与QT-PCR 法抗酸杆菌阳性检出率比较

涂片法结核杆菌的阳性例数为162 例，阳性检出率为2.29%；QT-PCR 法结核杆菌的阳性例数为281 例，阳性率为29.83%，对比两组的阳性检出率，QT-PCR 法高于涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3 组患者涂片法与QT-PCR 法抗酸杆菌阳性检出率比较[n(%)]

2.4 3 组患者涂片法与QT-PCR 法检验灵敏度、特异性和准确率比较

对352 例同时进行固体培养法、涂片法及QT-PCR法的病例进行分析，以固体培养法结果为标准。涂片法(取样1～3 次，首次阳性即记为阳性，否则继续采样第2次或第3 次，有1 次阳性则记为阳性)检测的灵敏度、特异性和准确率分别为69.78%、90.61%、82.39%；QTPCR 法检测的灵敏度、特异性和准确率分别为83.45%、86.85%、85.51%，QT-PCR 法灵敏度明显高于涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 352 例患者同时进行固体培养、涂片和QT-PCR 检测结果比较（%）

3 讨论

肺结核是一种慢性传染性疾病，该病是由结核分枝杆菌引起，会对患者全身的器官和组织造成伤害，对患者、家庭、社会均会带来较为严重的危害。目前我国的肺结核发病率逐年升高，并且结核病当中出现越来越多的耐药型病例，1 例活动性的肺结核患者每年可传染引起20 例左右的新发感染者，20%患者在早期无明显临床症状或症状较轻微，因此在结核分枝杆菌感染的最初阶段，快速检测到结核分枝杆菌，才能有效地从源头控制结核病的扩散[6-7]。临床常用的检测肺结核的方式主要有直接涂片抗酸染色镜检，即该次研究所用的涂片法、液体培养法和罗氏固体培养法，该次研究使用固体培养法，并作为研究的金标准，以及该次研究探索的QT-PCR 法检测，这种方法主要用于检测结核杆菌核酸。

涂片法是3 种检验方法中最早启用检测结核杆菌的方法，这种方法的优点是操作较为简单，便捷，且并不需要特殊仪器设备，适合无法开展分子检测的基层实验室使用。其局限性在于染色不仅结核分枝杆菌呈阳性，而非结核分枝杆菌如麻风杆菌也呈阳性；该方法还容易受到温度、染色时间、染色液质量，以及操作人员的主观意识影响；该方法使用的标本并未进行消化灭活，容易污染环境，老处理不当会存在巨大的生物安全风险；另外，标本荷菌量较低时，镜检也不易查见抗酸杆菌，假阴性的概率特别大，要求检测人员具备较高的技术水平和职业素养。据盛莉等[8]报道，留痰时留第1口痰和第2 口痰也会影响抗酸杆菌检出率。多方面因素导致不易控制检测工作的质量，且涂片法单次送检的阳性率比文中所诉阳性率更低，通常需多次送检，在检验的时效性与经济性上并不都优于QT-PCR 法[9]。

固体培养法作为检验的金标准，能够有效降低因标本产生的假阳性和假阴性的干扰因素，能够通过确定性的阳性标本去考核其他方法的真阳性率。但该方法培养周期长，且非结核分枝杆菌也有生长，实际工作中培养的菌落形态并非都能生长成典型的菜花样。根据标准和相关规定要求，结核杆菌的培养物如需开盖进行进一步检测，需在BSL-3 实验室中进行[10-11]。目前绝大多数医疗机构尚不具备此条件，因此，只能依靠肉眼观察菌落形态进行鉴别，故会导致假阳性率的提升，且该方法的灵敏度较低。

QT-PCR 法检测结核杆菌的特异性及灵敏度均较强，并且能够对不同类型的标本通过提取结核杆菌DNA 进行精确的检测，在很大程度上提高了结核杆菌检测的真阳性率和准确性，适用于体外难于培养和生长缓慢的病原体。QT-PCR 法根据试剂盒不同检测的靶基因不同，包括插入序列6110(IS6110)、IS986、16Sr-RNA、MPB64、MTP40、65KD、2 个或多个序列联合应用等[12-14],该研究中所采用的试剂盒的靶基因是针对结核分枝杆菌复合群所特有的IS6110 基因，不会受到各种分枝杆菌种（如龟、鸟、土地、施式、堪萨斯、亚洲分枝杆菌等）的影响，确诊的价值较为显著。随着全自动核酸提取仪的普及，能够进行自动化的批量操作，减少了人为因素的影响。但由于开展分子检测需要专门设计的基因扩增检测实验室，且需经专业培训取得上岗资质的人员才能进行操作，故结核杆菌核酸检测并未大范围普及[15]，在应用PCR 过程中还应该注意一些问题，例如在样本收集、处理、运送、保存过程中避免失误，提高工作质量，减少检测的误差，避免在处理标本过程中出现交叉污染等情况，降低假阳性率和假阴性率[16]。该研究中，QT-PCR 法的灵敏度为83.45%，明显高于涂片法，但仍然远低于厂家给定的灵敏度值，可能原因为：①没有去污步骤，不排除存在PCR 抑制因子，在低菌量时影响较大；②固体培养法存在一定的假阳性；③部分样本过于黏稠，核酸提取前的样本液化不完全。特异性为86.85%，导致特异性低的原因为：培养阴性而分子检测阳性的例数稍多，标本荷菌量太低可能会出现培养阴性结果，这与培养的手工操作和检测的敏感度有关。

该次研究将该院门诊与住院部收治的疑似结核病的患者作为研究对象，应用3 种方式进行结核杆菌检测，结果显示，7 066 张涂片中阳性例数为162 例，阳性率为2.29%；942 例样本进行了QT-PCR 法检测，阳性例数为281 例，阳性率为29.83%；固体培养法的结核杆菌的阳性例数为205 例，阳性率为36.54%，由于固体培养法标本均来源于结核门诊，并且作为该次研究的金标准，因此阳性率较高，但是依旧存在一定影响因素。而涂片法阳性率过低，原因可能为：①方法学局限；②与该研究中样本的来源有关，样本来源于各临床科室并非都来自于结核门诊，该研究中的涂片法阳性率也与相关报道的2.72%相近[17]。QT-PCR 法阳性率高于涂片法,且样本来源于涂片法相同，适合进行比较。涂片法检测的灵敏度为69.78%，QT-PCR 法灵敏度为83.45%，与吕纯芳等[18]报道的灵敏度为83.7%的数据相近。QTPCR 法灵敏度高于涂片法（P＜0.05）。结果表明，QTPCR 法阳性率、灵敏度、准确率均优于涂片法。涂片法影响因素较多，存在一定的漏诊率。PCR 方法灵敏度和特异性均较高，并且较为平均，检测的准确性更高。

综上所述，应用QT-PCR 法检测结核杆菌的应用价值更高，优于传统的涂片法，具有较高的阳性率、特异性和灵敏度，且QT-PCR 法可在接收标本的当日得出检测结论，时效性远优于固体培养法。如同时在PCR基础上应用固体培养法，能够增强准确性，最终确定患者结核杆菌为阳性，提高检测的准确率，因此可以临床推广，逐步替代涂片法。