抗逆转录病毒治疗对HIV-1感染者外周血CD19+B淋巴细胞的活化与凋亡的影响▲

李建明 熊润松 彭丽珊 王登嵘 杨 洋 刘 显 伍月榕 梁镕伊 梁淑家 肖 健,5

(广西中医药大学1 免疫学教研室，2 公共管理学院，南宁市 530020，电子邮箱：747110356@qq.com；3 重庆市武隆区疾病预防控制中心地方病与慢性病健康教育科，重庆市 408500；4 广西壮族自治区疾病预防控制中心艾滋病防制科，南宁市 530000；5 广西中医药大学广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁市 53022)

AIDS是由HIV-1感染所致，HIV-1入侵宿主后导致CD4+T淋巴细胞、单核巨噬细胞和B淋巴细胞等多种细胞的免疫应答失调[1-3]，且能在外周血和淋巴组织中检测到这些异常应答。HIV-1直接或间接地作用于免疫系统，进行性破坏免疫系统[4]，使得CD4+T淋巴细胞数量降低、功能缺陷，进而影响B淋巴细胞的活化及抗体的分泌，导致免疫系统功能失调[5]。HIV-1为逆转录病毒，因此抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)可极大程度地抑制HIV的复制，同时抗逆转录病毒药物的联用也对HIV的复制造成多重的障碍。CD19广泛表达于大多数B淋巴细胞，是B淋巴细胞受体识别抗原中关键的信号传递分子，也是B淋巴细胞表面的特异性标志，是参与B淋巴细胞活化、增殖、分化及抗体产生的重要膜抗原。目前，探讨外周血CD19+B淋巴细胞的免疫活化和耗竭与HIV-1感染进程相关性的研究较少。本研究应用流式细胞术检测CD19+B淋巴细胞活化指标CD38、耗竭指标CD95和程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)的表达情况，分析在HIV-1感染过程中CD19+B淋巴细胞的活化和耗竭情况，探讨ART对HIV-1感染者CD19+B淋巴细胞水平及其CD38、CD95和PD-1水平的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2016～2018年在广西疾病预防控制中心就诊的101例HIV-1感染者为研究对象，年龄7～86岁，中位年龄39岁，其中男性78例、女性23例。纳入标准：感染至纳入研究时间不超过10年，CD4+T淋巴细胞计数<350个/μL。排除合并HBV、HCV感染。根据是否进行过ART，分为未治疗组73例(无特殊病史，体检显示无其他异常)和治疗组28例。未治疗组中男性61例、女性12例，年龄(37.45±15.65)岁；治疗组中男性17例、女性11例，年龄(33.39±15.38)岁。另设健康对照组30例，纳入标准：HIV-1阴性，身体健康，无疾病史、过敏史及免疫治疗史。排除合并HBV、HCV感染。其中男性12例、女性18例，年龄12～80(31.43±12.40)岁。3组研究对象的年龄和性别构成等一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究获得广西中医药大学医学伦理学委员会批准，所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 流式细胞仪购自美国BD公司(型号：CytoFLEX)，台式水平离心机购自德国Eppendorf公司(型号：AG5453)。人淋巴细胞分离液购自Solarbio公司(生产批号：P8610)，RPMI-1640培养基购自Solarbio公司(生产批号：11875)，磷酸缓冲盐溶液购自Solarbio公司(生产批号：1020)，流式抗体Anti-Human CD19 APC-Cy7(生产批号：557791)，Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5(生产批号：551400)、Anti-Human CD95 PE-Cy7(生产批号：555674)、Anti-Human PD-1 APC(生产批号：558694)均购自美国BD公司，4%多聚甲醛购自BioSharp公司(生产批号：BL539A)。

1.3 检测方法 于清晨抽取纳入对象空腹状态下的外周静脉血10 mL，存放于EDTA管中，再用淋巴细胞分离液常规分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。采用流式细胞仪检测CD19、CD38、PD-1、CD95的表达水平：每个样本取50 μL PBMC悬液，加入1 μL的相对应荧光素标记的抗人单克隆抗体，即Anti-Human CD19 APC-Cy7、Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5、Anti-Human CD95 PE-Cy7、Anti-Human PD-1 APC，在4℃条件下避光孵育30 min，用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次并弃去上清后，再用500 μL的1%多聚甲醛固定重悬，最后用流式细胞仪上机检测。本研究以CD19+B淋巴细胞作为细胞群，以荧光扣除对照作为设门依据，分析CD19+B淋巴细胞群上CD38、PD-1、CD95的表达水平。

1.4 设门策略 通过调整前向角散光(forward scatter,FSC)和侧向角散射光(side scatter，SSC)选取PBMC，从选定的细胞群中根据所标记荧光设门CD19+B淋巴细胞，再从CD19+B淋巴细胞中设门观察CD38、CD95、PD-1的表达情况，见图1。

图1 人PBMC设门策略

1.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布的计量资料以[M(P25,P75)]表示，比较采用非参数秩和检验。绘制散点图并采用相关分析法分析CD19+B淋巴细胞水平以及CD95、CD38、PD-1表达量之间的关系。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组CD19+B淋巴细胞水平的比较 未治疗组、治疗组、健康对照组CD19+B淋巴细胞水平依次升高(均P<0.05)，见表1和图2。

表1 3组CD19+B淋巴细胞水平的比较[M(P25，P75)，%]

图2 各组CD19+B淋巴细胞水平检测结果

2.2 3组CD19+B淋巴细胞CD38表达水平的比较 健康对照组和治疗组CD19+B淋巴细胞CD38的表达水平均低于未治疗组(均P<0.05)，而治疗组和健康对照组CD19+B淋巴细胞CD38的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2和图3。

表2 3组CD19+B淋巴细胞CD38表达水平的比较[M(P25，P75)，%]

图3 各组CD19+B淋巴细胞CD95的表达情况

2.3 3组CD19+B淋巴细胞CD95表达水平的比较 未治疗组、治疗组、健康对照组CD19+B淋巴细胞CD95的表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3和图4。

表3 3组CD19+B淋巴细胞CD95表达水平的比较(x±s，%)

图4 各组CD19+B淋巴细胞CD95的表达情况

2.4 3组CD19+B淋巴细胞PD-1表达水平的比较 未治疗组和治疗组CD19+B淋巴细胞PD-1的表达水平均高于健康对照组(均P<0.05)，而治疗组与未治疗组CD19+B淋巴细胞PD-1的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图5。

表4 3组CD19+B淋巴细胞PD-1表达水平的比较[M(P25，P75)，%]

图5 各组CD19+B淋巴细胞PD-1的表达情况

2.5 未治疗组CD19+B淋巴细胞水平、CD95、CD38、PD-1表达水平之间的相关性 相关分析结果显示，未治疗组HIV-1感染者外周血CD19+B淋巴细胞水平与CD38的表达水平、CD95的表达水平、PD-1的表达水平均不相关(均P>0.05)；CD38的表达水平与CD95的表达呈正相关(P<0.05)，而与PD-1的表达水平不相关(P>0.05)；CD95的表达水平与PD-1的表达水平间也无相关性(P>0.05)。见图6。

图6 未治疗组中CD19+B淋巴细胞水平以及CD38、CD95、PD-1表达水平之间的相关性

2.6 治疗组外周血CD19+B淋巴细胞水平、CD95、CD38、PD-1 表达水平的相关性 相关性分析结果显示，治疗组HIV-1患者外周血CD19+B淋巴细胞水平以及CD38、CD95、PD-1的表达水平，两两之间均不相关(均P>0.05)。见图7。

图7 治疗组中CD19+B淋巴细胞水平以及CD38、CD95、PD-1表达水平之间的相关性

3 讨 论

HIV-1感染会导致机体淋巴细胞异常，如CD4+T淋巴细胞、单核巨噬细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞等。CD4+T淋巴细胞数量随着感染的进展持续性减少，常作为HIV感染的临床分期依据[6-7]。本研究中未治疗组、治疗组、健康对照组CD19+B淋巴细胞的百分比依次升高(均P<0.05)。这提示ART可能影响HIV-1感染者外周血中CD19+B淋巴细胞的表达。随着HIV-1感染的进展，CD19+B淋巴细胞的表达可能是动态变化的，细胞的活化与耗竭可能是并存的。为进一步探究CD19+B淋巴细胞活化与耗竭的变化规律，我们选取CD38、CD95、PD-1这几个指标进行进一步研究。

CD38存在于B淋巴细胞表面，与B淋巴细胞的活化相关，CD38与B淋巴细胞受体以及CD19/CD21/CD81共受体等组成共刺激复合物，在复合物的刺激下B淋巴细胞的活化阈值降低，此外，CD38可激活磷脂酰肌醇激酶途径，促进B淋巴细胞的发育[8-9]。HIV-1感染可导致CD38表达升高，CD38的表达与体内HIV-1的载量呈正相关，因此CD38可间接反映体内的HIV-1载量[10]。本研究结果显示，未治疗组的CD19+B淋巴细胞的CD38表达水平高于治疗组和健康对照组(均P<0.05)，提示，在HIV-1感染进程中CD19+B淋巴细胞水平降低，导致CD19+B淋巴细胞的活化阈值降低，CD38随之表达并促进CD19+B淋巴细胞的成熟、修复。而治疗组与健康对照组CD19+B淋巴细胞的CD38表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示ART可能作用于CD38，活化CD19+B淋巴细胞，从而弥补HIV-1感染造成的B淋巴细胞受损。

CD95主要存在于活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞表面，可通过依赖胱天蛋白酶通路介导细胞凋亡[11]。研究显示，未经治疗的HIV-1感染者的B淋巴细胞中CD95的表达增加，这可能导致细胞的加速更新以及细胞对病原体、疫苗抗原的记忆丧失[12-14]。本研究中，未治疗组、治疗组、健康对照组CD19+B淋巴细胞CD95的表达水平依次降低(P<0.05)，即经ART后HIV感染者的CD95表达水平虽较未治疗组低，但仍高于健康对照组，不能完全恢复到健康人的状态。这提示ART部分作用于CD95，而CD95能介导凋亡，诱导CD19+B淋巴细胞凋亡，间接抑制了体液免疫[15]。

PD-1参与HIV-1的感染进程，在T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞等细胞中均有表达，它能通过抑制机体的免疫功能，促进疾病发展[16-19]。相关研究表明，HIV-1患者外周血中可溶性PD-1含量高于健康对照组，且与病毒载量呈正相关，与CD4淋巴细胞计数呈负相关[20]；在HIV-1感染进程中，CD8+T淋巴细胞中PD-1表达水平影响CD8+T淋巴细胞的活化及功能[21]。在本研究中，治疗组、未治疗组CD19+B淋巴细胞的PD-1表达水平均高于健康对照组(均P<0.05)，但治疗组与未治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)，这提示ART可能不作用于PD-1。

我们为进一步分析CD19+B淋巴细胞耗竭与活化之间的相关性。结果显示，治疗组外周血CD19+B淋巴细胞水平及CD19+B淋巴细胞上的CD38、PD-1、CD95的表达水平之间均不相关(均P>0.05)；在未治疗组中仅有CD38与CD95的表达水平之间呈正相关(P<0.05)，而其他指标之间均不存在相关性(均P>0.05)。这提示在HIV-1感染者中CD19+B淋巴细胞的活化与耗竭间存在正相关关系，且ART可能影响CD38与CD95之间的互作用。

综上所述，ART可能通过影响HIV-1感染者CD19+B淋巴细胞中CD38与CD95的表达及二者之间的相互作用，对HIV-1感染者的体液免疫功能发挥一定的修复作用。ART可能不影响HIV-1感染者CD19+B淋巴细胞中PD-1的表达水平。ART增强CD19+B淋巴细胞活化并抑制其凋亡的作用，或可成为今后抗HIV-1感染的一个新思路。