高危型人乳头瘤病毒载量和P16蛋白预测蒙古族宫颈上皮内瘤变Ⅰ级患者病变转归的价值▲

孙晓峰 汪 峰 岑 尧 胡玉崇 萨日娜 杨慧君

(1 包头医学院内蒙古临床医学院，包头市 014040，电子邮箱:312432187@qq.com；内蒙古自治区人民医院2 病理科，3 妇产科，呼和浩特市 010016)

根据国际癌症研究署公布的数据,2012年全球宫颈癌新增病例约52.8万,死亡病例约27万,其中超过一半的新发病例和死亡病例发生于欠发达地区[1]。宫颈癌呈现出高发病率、高死亡率及年轻化特征[2]。由于缺乏有效的筛查程序，宫颈癌成为发展中国家的公共卫生问题之一，众多发展中国家必须制定简单、廉价、有效的策略以应对宫颈癌的筛查和治疗[3]。由于受到种族及地域的影响，不同人群的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染峰值年龄、流行病学现状以及感染病毒类型不同[4-5]，其中性活跃女性感染率较高，感染峰龄在18～28岁[6]。中国是宫颈癌的高发地区之一，每年新发病例约9.89万例，死亡病例约3.05万例[7]。中国是多民族聚居的国家，其HPV感染型别及发病率呈现不同的特征。我国学者通过对内蒙古地区女性开展早期诊断筛查，发现蒙古族与汉族女性HPV感染的优势型别排序相同[2]。但目前鲜少有关于蒙古族女性宫颈癌预后标志物的相关研究成果。本研究分析宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ,CINⅠ)的蒙古族女性病变组织中高危型HPV载量与P16蛋白表达的相关性，以及联合应用两者预测患者组织学转归的可行性，以期为蒙古族女性宫颈CINⅠ患者的精准治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月至2017年12月期间，于内蒙古自治区人民医院妇科门诊就诊的118例蒙古族女性CINⅠ患者作为研究对象。纳入标准：户籍上民族为蒙古族的中国公民；有性生活史3年以上；行薄层液基细胞学检查；在阴道镜检查满意的前提下行阴道镜下宫颈多点活检及宫颈搔刮术，经组织病理学检查确诊；患者签署知情同意书；患者自愿接受并配合随访；具备随访条件且近3个月内未经药物或物理治疗。排除标准：妊娠期女性；合并其他免疫系统疾病或服用相关抑制剂等女性。118例CINⅠ患者年龄18～67岁，其中18～<49岁共76例，49～67岁共42例。

1.2 高危型HPV载量的检测 于月经结束后3～7 d进行检测，检测前应避免性生活、阴道冲洗及阴道栓剂药物的使用，排除存在阴道炎性疾病、阴道内置入药物治疗或理疗史、宫颈锥切或子宫手术史。受检者取妇科检查截石位，以窥器充分暴露宫颈后，拭去表面分泌物，用专用子宫颈脱落细胞采集器尖端伸入宫颈内口，直到两翼刷毛和宫颈口两侧紧密接触，大拇指与食指握住刷柄，朝一个方向旋转2～5圈以获得足量细胞样本，抽出宫颈刷后将宫颈刷静置于洗脱管的专用细胞封存液中，沿刷柄固定折痕处折断，紧旋洗脱管盖，直立放置，然后对送检小瓶进行编号，标注详细信息，1周内送检。采用二代杂交捕获术检测高危型HPV载量，检测试剂购自杭州德同生物技术有限公司(批号：SPS20J02)，可检测的HPV类型包括高危型HPV16、HPV18以及非高危型HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68。HPV-DNA含量以检测样本的相对光单位(relative light unit，RLU)与标准阳性对照平均值(cut of ration，CO)的比值表示[8]。RLU/CO值<1为阴性，RLU/CO值≥1为阳性，其中1≤RLU/CO值<10为低载量，10≤RLU/CO值<100为中低载量，100≤RLU/CO值<1 000为中高载量，RLU/CO值≥1 000为高载量。

1.3 P16蛋白表达的检测 阴道镜下宫颈活检留取病变组织，以3 μm[9]作为本研究的切片厚度标准。参照文献[10]，采用免疫组化方法检测P16蛋白的表达，检测试剂购自罗氏公司(生产批号：ZKSP-10448)。采用显微摄像计算机(×100)分析蛋白表达情况(排除间质细胞阳性)：P16蛋白主要定位于胞核或胞质中，若染色后呈棕黄色即判定为阳性[11]。参照文献[8]将染色强度分为4级，其中无染为0，低染为1，中染为2，强染为3；阳性细胞百分率为0%评为0分，<10%评为1分，10%～50%评为2分，51%～80%评为3分，>80%评为4分；蛋白表达评分=染色强度×阳性细胞百分率得分，评分在0～12分之间。按评分进行分级，其中 <4分为(-)， 4～5分为(+)， 6～8分为(++)，9～12分为(+++)。

1.4 随访及组织学转归判定 分别于确诊后6、12、18、24个月进行随访观察，复查薄层液基细胞学、阴道镜，必要时行子宫颈活检、子宫颈环形电切术或行子宫颈锥切手术，并将组织病理学检查结果作为组织学转归结局；未行手术治疗者，则于确诊后24个月随访时再次给予阴道镜下宫颈多点活检术，确定其组织学转归结局。研究期间以避孕套作为主要避孕方法。病变结局分为病变不进展(含病变消退、病变持续)和病变进展， 其中没有发现CIN病变存在或存在类型较前轻微者判定为病变消退，CINⅠ病变未发生改变者判定为病变持续，发现宫颈上皮内瘤变Ⅱ级(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅱ,CINⅡ)及以上病变者判定为病变进展。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分比表示，趋势分析采用趋势χ2检验；采用Spearman等级相关分析评估指标间的相关性；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价相关指标的诊断效能。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CINⅠ患者病变组织中高危型HPV载量与P16蛋白表达情况及两者的关系 118例蒙古族CINⅠ患者中，47例(39.83%)P16蛋白阳性，其中(+)30例(25.42%)，(++)9例(7.63%)，(+++)8例(6.78%)，见图1。高危型HPV 阳性率为70.34%(83/118)，主要集中于中低载量组及中高载量组，见表1。CINⅠ患者病变组织P16蛋白表达分级与HPV载量呈正相关(rs=0.569，P=0.014)。

P16蛋白(+) P16蛋白(++) P16蛋白(+++)

表1 118例CINⅠ患者病变组织中高危型HPV载量与P16蛋白表达情况

2.2 CINIⅠ患者高危型HPV载量和P16蛋白表达分级与组织学转归的关系 118例患者均按时完成随访，共有14例患者病情发生进展，104例病情未发生进展的患者中，病变自然消退68例，病变持续36例。其中，共5例进展为宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅲ,CINⅢ)，于随访至第12个月、18个月分别发现1例、4例，已行手术治疗；共9例进展为CINⅡ，其中随访至第18个月时发现3例并给予子宫颈环形电切术或子宫颈锥形切除术，随访至第12、24个月时分别发现5例、1例，因患者对手术治疗持质疑态度，表示仍要继续随访，遵循患者意见继续随访观察。随着P16蛋白表达分级升高和HPV载量增加，CINⅠ患者病变进展率有增高的趋势(均P<0.05)，见表2及表3。

表2 不同组织学转归蒙古族CINⅠ患者的高危型HPV载量的比较情况(n)

表3 不同组织学转归蒙古族CINⅠ患者的P16蛋白表达分级的比较情况(n)

2.3 高危型HPV载量和P16蛋白表达评分预测蒙古族CINⅠ病变进展的效能 以病理结果作为金标准，以P16蛋白表达评分≥4分、≥6分、≥9分，以及高危型HPV载量≥1 RLU/CO、≥10 RLU/CO、≥100 RLU/CO作为诊断界值，分析P16蛋白表达评分和高危型HPV载量单独或联合预测蒙古族CINⅠ患者病变进展的效能。结果显示，P16蛋白表达评分≥6分联合高危型HPV载量≥100 RLU/CO的曲线下面积、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均较高，见表4。

表4 不同临界值P16蛋白表达评分和高危型HPV载量单独或联合预测蒙古族CINⅠ患者病变进展的效能

3 讨 论

CINⅠ患者病变部位的子宫颈细胞处于不稳定状态,为HPV感染的早期状态，可随病毒感染的不同状态发生细胞学形态上的改变；因其自然消退率高，细胞学检查为CINⅠ及以下、细胞学正常伴HPV感染的患者只需药物治疗和随访观察[12]。本组118例蒙古族CINⅠ女性随访观察24个月，共68例病变自然消退，自然消退率为57.63%(68/118)，病变持续率为30.51%(36/118)。这提示，经严格随访，半数以上的CINⅠ病例可以达到临床治愈的效果，但对于病变持续的患者，给予积极干预对实现有效转归很关键。

本研究中，蒙古族CINⅠ患者P16蛋白阳性率达39.83%，且P16蛋白表达与HPV病毒载量之间呈正相关(P<0.05)，即在P16蛋白强阳性表达的同时伴随高危型HPV的高负荷量，这进一步阐明高病毒载量的高危型HPV诱导宿主抑癌基因发生改变，P16蛋白的异常表达是高危型HPV感染并导致宿主细胞变异的外在表现，其用于预测病变转归更值得临床参考。本研究结果显示，CINⅠ病变发生进展的患者主要为P16蛋白(++)、(+++)的患者，以及高危型HPV低载量及以上的患者，随着P16蛋白表达分级增加或高危型HPV病毒载量增加，CINⅠ患者病变进展率均有升高趋势(均P<0.05)。由此可见，宫颈病变与高危型HPV载量和P16蛋白阳性均关系密切。以病理结果作为金标准，分析高危型HPV载量和P16蛋白表达评分单独或联合预测病变进展的效能，发现P16蛋白表达评分≥6分联合高危型HPV载量≥100 RLU/CO对疾病进展的预测效能比较高。即在CINⅠ的转归预测中，P16蛋白表达评分≥6分联合HPV载量≥100 RLU/CO可以对宫颈病变进展起到较好的预测作用。

总之，对于宫颈癌初筛患者，二代杂交捕获术检测无创伤，操作简便，具有高度敏感性、主观性极小，值得在临床实践中推广和应用。对于组织学确诊为CINⅠ的内蒙古族患者，采用P16蛋白免疫组化检查进行分流，特别是针对P16蛋白表达评分≥6分、高危型HPV载量≥100 RLU/CO的患者，应及时及早给予积极临床干预，有利于预防病变进展。今后将扩大样本量、丰富样本类型，进行更加深入的探究，以探寻更加科学、人性化且及时有效的预防筛查方法和策略。