基质金属蛋白酶组织抑制剂-2、基质金属蛋白酶-13及c-fos蛋白表达与合并髂静脉狭窄下肢静脉曲张患者病情严重程度相关性分析

李荣华， 陈 磊， 武慧娟， 王树艳， 姜海军

承德医学院附属医院 血管普外科，河北 承德 067000

下肢静脉曲张(varicose veins of lower extremity，VVLE)是指浅表静脉过度扩张、迂曲，产生下肢酸痛、肿胀等临床症状的皮肤微循环障碍综合征。髂静脉压迫综合征是VVLE中的一种，随着年龄的增长，其发病率明显升高，严重影响老年患者的生活质量[1]。目前，临床对于VVLE的治疗方式主要以静脉内血管硬化术、经皮静脉生物瓣膜植入术及射频治疗为主，但复发率高，难以根治。临床主要以大隐静脉曲张较多见，但对于其具体的发病机制尚不清楚。近年来，有研究认为，静脉曲张可能与血管重塑有关[2]。大隐静脉管壁中含有丰富的细胞外基质和血管平滑肌，分别发挥血管扩张和收缩的功能，从而维持血管完整性。血管重塑即为细胞外基质和血管平滑肌发生结构性改变。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是降解细胞外基质的主要酶家族，能够降解细胞外基质成分；基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP)是MMP相关性抑制剂，与MMP共同调节细胞外基质的代谢[3]。正常组织中，MMP表达量很少甚至不表达，但当机体处于病理状态下，MMP表达量增加。因此，有学者认为，MMP、TIMP参加血管生长、发育和血管重塑等多个过程[4-5]。MMP-13作为MMP家族一员，能够显著降解胶原的三螺旋区[6]；TIMP-2作为TIMP家族的代表成员，参与血管重塑过程；c-fos与MMP合成有关，有学者推断c-fos基因参与调控血管扩张和收缩[7]。本研究通过免疫组织化学法和反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)检测VVLE患者的MMP-13、TIMP-2和c-fos蛋白的表达情况，通过Pearson相关性分析，明确以上各蛋白对VVLE诊断的意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2017年12月至2018年12月承德医学院附属医院收治的200例合并髂静脉狭窄的VVLE患者为研究对象。纳入标准：(1)存在髂静脉狭窄；(2)术前3个月无激素使用史；(3)从未进行过抗凝治疗。排除标准：(1)单纯VVLE或其他静脉曲张类型疾病；(2)具有深静脉血栓；(3)不愿意手术；(4)有重大脏器手术史、精神障碍史；(5)对造影剂过敏。所有患者均通过下肢深静脉顺行造影确定，根据髂总静脉狭窄程度进行分类，其中，轻度组(n=67)不进行手术干预，中度组(n=88)、重度组(n=45)进行腔内治疗。合并髂静脉狭窄的VVLE评判标准[8]：轻度组，患者髂总静脉顺畅，仅见单纯盆腔侧枝存在狭窄，狭窄率<50%；中度组，患者髂总静脉血流基本通畅，但可见左髂内静脉或其他盆腔粗大侧枝存在狭窄，狭窄率50%～70%；重度组，髂总静脉存在明显狭窄或中断，且伴有盆腔侧枝静脉存在狭窄，狭窄率≥70%。另选取同期于我院体检中心进行体检的50 例健康者作为健康组，无精神疾病，无VVLE病史。健康组中，男性35例，女性15例；平均年龄(50.34±6.09)岁。轻度组中，男性45例，女性22例；平均年龄(51.25±6.18)岁。中度组中，男性53例，女性35例；平均年龄(52.52±6.26)岁。重度组中，男性31例，女性14例；平均年龄(51.48±6.16)岁。各组研究对象的一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达水平检测 采用免疫组织化学法检测MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达水平。(1)试剂与仪器：兔抗人MMP-13、兔抗人TIMP-2 、兔抗人c-fos多克隆抗体，DAB显色剂，各蛋白的免疫组织化学检测试剂盒均购自Abcam公司；甲醇、磷酸盐缓冲液等试剂均由医院购买，采用国产分析纯级。(2)实验操作步骤：术中采取大隐静脉的组织标本放入冰中，随后放入冰箱，次日取出组织用10%甲醛固定1 d，然后用不同浓度乙醇脱水过夜、透明，次日用石蜡包埋，切成4 μm厚的切片并进行编号，放入盒中备用。选用不同蛋白的免疫组织化学试剂盒按照按说明方法检测样本中MMP-13、TIMP-2、c-fos的表达含量，然后用DAB显色剂对组织进行显色，显微镜下观察MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达情况。(3)样本免疫组织化学判断标准：MMP-13、TIMP-2的细胞质呈棕黄色或棕褐色的颗粒状为阳性染色，c-fos细胞核呈棕黄色为阳性染色。随机选取10个高倍镜视野计算阳性细胞数目，其中，阳性细胞数目≤25%为阴性，25%～50%为弱阳性，50%～75% 为阳性，阳性细胞数目>75%为强阳性。

阳性率=[弱阳性数(+)+阳性数(++)+强阳性数(+++)]/总数×100%

1.2.2 MMP-13 mRNA、TIMP-2 mRNA、c-fos mRNA表达水平检测 采用RT-PCR检测MMP-13mRNA、TIMP-2 mRNA、c-fos mRNA表达情况。根据Trizol试剂盒的说明书对术中标本进行提取(所有步骤在超净台内，并在冰上操作完成)。RT-PCR反应按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书制备，cDNA反应液的配制如下：反应体积20 μl，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃循环。取出cDNA产物，用DEPC水稀释5倍，再进行RT-PCR反应，反应液的配制如下：反应体积15 μl，反应条件为94℃ 预变性4 min；循环体系94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，循环30次，72℃延伸10 min。各蛋白引物设计如下。β-actin：F:5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R:5′-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′；MMP-13：F:5′-AAATTATGGAGGAGATGCCCA TT-3′，R:5′-TCCTTGGAGTGGTCAAGACCTAA-3′；TIMP-2：F:5′-GAGCCTGAACCACAGGTACCA-3′，R:5′-AGGAGATGTAGCACGGGATCA-3′，c-fos：F5′-GGCAGAAGGGGCAAAGTAGA-3′，R 5′-GTTGATCTGTCTCCGCTTGG-3′。

2 结果

2.1 各组研究对象MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达阳性率比较 健康组MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达阳性率均低于轻度组、中度组及重度组，且随着VVLE病情的加重，MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表达阳性率均逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～3。

表1 各组研究对象MMP-13蛋白表达阳性率比较

表2 各组研究对象TIMP-2蛋白表达阳性率比较

表3 各组研究对象c-fos蛋白表达阳性率比较

2.2 各组研究对象TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表达水平比较 健康组TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表达水平均低于轻度组、中度组及重度组，且随着VVLE的病情加重，TIMP-2 mRNA、MMP-13mRNA、c-fos mRNA表达水平均逐渐增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组研究对象TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表达水平比较

2.3 相关性分析 TIMP-2蛋白表达与VVLE狭窄程度无相关性(r=0.126，P>0.05)；MMP-13、c-fos蛋白表达与VVLE狭窄程度呈正相关(r=0.210、0.139，P<0.05)。

3 讨论

静脉曲张可致皮肤内毛细血管压力增高、血液成分渗出，进而引起皮肤软组织代谢功能障碍，色素沉着、皮肤萎缩、溃疡等，是外科常见疾病，多以下肢大隐静脉为主，该病发病率高，严重影响患者的生活质量[9]。溃疡和出血是慢性静脉疾病的并发症，一般无致命危害，但少数会发生出血，威胁患者生命安全[10]。对于静脉曲张的治疗一直有不同争议，轻症患者多采用保守治疗，中、重度患者建议采用手术治疗[11]。近年来，随着医疗技术的迅猛发展，VVLE的手术治疗方法越来越多，但关于静脉曲张发病机制的研究尚不充足。

有学者认为，血管重塑是静脉曲张的病理基础[12]。还有学者认为，静脉曲张的发生机制有多种，一是随着年龄增加，静脉壁失去弹性；二是静脉瓣膜缺失或功能障碍；三是肌肉泵系统功能障碍，静脉系统阻塞；以上综合原因导致了下肢静脉高压和静脉扩张，进而引起静脉曲张[13]。正常静脉壁由外膜、中膜和内膜组成。内膜主要由弹性蛋白、胶原和蛋白多糖细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，以支持静脉的弹性回缩。内膜层还包含瓣膜，以保持血液以单一向上的方向流向心脏[14]。

MMP共有24个家族成员，是一类催化ECM蛋白降解的中性内肽酶，可能影响血管舒张、血管平滑肌细胞的迁移和增殖[15]。MMP活性可被4种不同的TIMP抑制，通过平衡MMP和TIMP的表达来实现组织内稳态。当这种平衡被破坏时，MMP活性失调就会导致许多疾病，如癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病和关节炎[16]。近年来，MMP和TIMP在血管重塑中的作用越来越被大家接受[17]。本研究结果显示，随着VVLE病情加剧，MMP-13、TIMP-2的表达显著增加，说明在静脉曲张的病程发展过程中，血管外基质明显被降解破坏；但通过进一步的mRNA表达的半定量检测发现，MMP-13和TIMP-2均升高，且随着病情严重程度的加重而增加。Beidler等[18]研究检测静脉曲张溃疡患者皮损中的MMP-13、MMP-12高于正常组织，且溃疡愈合程度越高，MMP-13水平越低，说明静脉曲张溃疡皮损中的MMP-13上调将抑制其愈合。本研究结果显示，c-fos蛋白表达明显增加，趋势与MMP-13一致。Pan等[19]研究报道，c-fos表达促进MMP-9和MMP-2的表达。最后，本研究进行了MMP-13和TIMP-2、c-fos表达与VVLE病情相关性的研究，结果表明，MMP-13、c-fos表达与VVLE狭窄程度呈正相关。

综上所述，MMP-13、c-fos蛋白表达与VVLE病情严重程度存在相关性，对VVLE的诊断具有重要意义。