全蝎和蜈蚣的多肽粗提物对肝癌细胞中HBV的抑制作用

马青，杨扬，马韬，徐卫东，赵明

(1. 江苏大学药学院，江苏 镇江 212013； 2. 上海计划生育科学研究所，上海 200032； 3. 上海交通大学附属瑞金医院普外科，上海 200025)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可诱发肝癌，导致全球每年超过100万人死亡[1]。HBV闭合环状DNA合成下一代病毒RNA[2]，前基因组RNA编码HBV聚合酶和HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)[3]，病毒逆转录酶合成HBV基因组的负链[4]。HBV基因组编码4个开放阅读区：P、C、S、X，其中P基因编码病毒聚合酶，C基因编码核衣壳的结构蛋白以及HBV核心抗原(HBeAg)，S基因编码3种不同的包膜糖蛋白，包括HBV表面抗原(HBsAg)，而X基因编码多功能X蛋白[1]。HBV主要治疗药物是核苷酸类似物，如拉米夫定和恩替卡韦，其中，拉米夫定主要通过抑制病毒逆转录酶活性抑制HBV产生[5-6]，而恩替卡韦对HBV聚合酶具有很高的选择性，长期服用可能造成患者肝损伤。全蝎(ButhusmartensiiKarsch)及蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)作为广谱性抗病毒中药材，从中提取的某些毒性肽具有抗病毒作用[7-9]。以往研究表明，全蝎和蜈蚣的活性多肽的分子量分别集中在5～10 kDa和5 kDa以下两个主要区域[10-12]。肝癌HepAD38细胞在诱导型四环素启动子的控制下可以产生HBV，当去除细胞培养液中四环素后，可诱导HBV RNA转录和蛋白质合成。目前，全蝎和蜈蚣的多肽是否具有抗HBV活性尚不清楚。因此，本研究拟通过对全蝎尾部提取的5～10 kDa多肽(PEST)和蜈蚣头部提取的5 kDa以下多肽(PECH)2个组分与HepAD38细胞体外共培养，行抗HBV活性研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器

全蝎和蜈蚣购自江苏大学附属医院，由江苏大学医学院赵明主任中药师完成样本鉴定。肝癌HepAD38细胞、HepG2细胞均由上海计划生育科学研究所分子实验室赠予。

DMEM、Trizol(美国Thermo Fisher公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；100×青霉素/链霉素溶液(上海源培生物科技股份有限公司)；四环素(睿铂赛生物科技有限公司)；MTT(上海生工生物工程有限公司)；微型分光光度计ASP-3700(美国ACTGene公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；PBST(澳大利亚Devondale公司)；PVDF膜、GAPDH(美国Abcam Biotechnology公司)；鼠抗HBc，兔抗GAPDH，山羊抗兔或抗鼠IgG(美国Cell Signaling 公司)；化学发光试剂(北京Key-Bio公司)；RT-6500酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；HBV核酸扩增(PCR)荧光定量试剂盒(中美生物技术公司)；HBsAg诊断试剂盒(万泰生物药业股份有限公司)；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(德国天根生化科技公司)；Light Cycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR系统(美国Roche公司)；Tanon-5200化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)；二甲基亚砜、拉米夫定、恩替卡韦均购自美国Sigma-Aldrich公司；其余生化试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养

HepAD38细胞培养于含DMEM、10%胎牛血清、100×青霉素/链霉素溶液和6.86 μmol/L四环素的培养基中。HepG2细胞培养在无四环素的相同培养基中。培养条件为温度37 ℃，含5% CO2。

1.3 多肽提取物制备及浓度与重金属测定

取全蝎尾部与蜈蚣头部，用0.5 mL PBS清洗3次；加入0.2×PBS于4 ℃匀浆；4 ℃，2 000×g离心30 min、离心2次收集上清液；5 000×g，4 ℃超滤10 min；加入200 μL PBS重复超滤3次；分别收集全蝎5～10 kDa超滤液，蜈蚣5 kDa以下超滤液；于-80 ℃保存2 h；用冷冻干燥器浓缩至1/5；浓缩液以4 ℃、2 000 ×g离心20 min，收集上清液；全蝎和蜈蚣的多肽提取物分别命名为PEST和PECH。多肽浓度直接通过微型分光光度计测量，取部分送由中国科学院南京土壤研究所测定重金属含量。剩余于-80 ℃保存。

1.4 细胞活力与HBV DNA含量检测

1.4.1 细胞分组和处理 HepAD38细胞常规培养48 h。细胞分组如下：对照组采用空白培养基培养；PEST组：分别用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST处理；PECH组：分别用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH处理；阳性对照组：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韦或6.860 μmol/L四环素；培养48 h。更换含上述药物培养基或空白培养基，再培养72 h，收集上清液保存于-80 ℃用于HBV DNA测定，其余用于细胞活力测定。HepG2细胞常规培养12 h，细胞分组如下：对照组采用空白培养基培养；PEST组：分别用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST处理；PECH组：分别用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH处理；分别培养24、48、72 h，用于细胞活力测定。筛选PEST和PECH活性浓度范围。

1.4.2 MTT法检测细胞活力 培养板中每孔加入90 μL培养基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h；加入150 μL DMSO，振荡10 min以溶解结晶；用酶标仪检测570 nm处光密度(D)值。细胞活力(%)=(实验组D值-调零孔D值)/对照组D值-调零孔D值)×100%。

1.4.3 qRT-PCR检测HBV DNA含量 从HepAD38细胞上清液中提取HBV DNA；qRT-PCR检测：18.8 μL HBV PCR反应液+0.2 μLTaq酶+0.03 μL尿嘧啶-N-糖基化酶，混合均匀后取19 μL分装入PCR管，加入1 μL待测样本DNA，共20 μL总反应体系；37 ℃反应5 min，95 ℃变性3 min，接着95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，50个循环。羧基荧光素检测通道(FAM)收集信号，60 ℃收集数据。HBV DNA拷贝数用不同浓度HBV标准品制成的标准曲线进行定量。

1.5 HBV抗原含量、mRNA相对表达以及HBc含量检测

1.5.1 细胞分组和处理 HepAD38细胞常规培养48 h。对照组采用空白培养基培养；PEST组和PECH组分别用1 mg/mL PEST、PECH处理；阳性对照组：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韦或6.860 μmol/L四环素；培养48 h；更换相应培养基再培养72 h。取上清液检测HBsAg和HBeAg含量，细胞用于qRT-PCR检测X/S/preC/PmRNA相对表达和HBc表达。

1.5.2 ELISA法检测HBsAg和HBeAg含量 检测HBsAg时， 每组设3个复孔，标准品孔中加入标准品溶液各50 μL，样本孔中加入样本溶液各10 μL和稀释液40 μL，再加入100 μL检测抗体，封闭，于37 ℃孵育60 min；检测HBeAg时，样品孔和阴性对照设3个复孔，阳性对照设2个复孔，相应孔中加入待测溶液各50 μL和酶标试剂50 μL，封闭，于37 ℃孵育30 min。两种微孔板均洗涤5次，毎孔加入A液、B液各50 μL，于37 ℃孵育15 min，加终止液50 μL，立即用酶标仪以双波长450 nm/600～650 nm进行检测。具体操作步骤按说明书进行。计算HBsAg和HBeAg的相对含量：相对含量(%)=(实验组D值-调零孔D值)/对照组D值-调零孔D值)×100%。

1.5.3 qRT-PCR检测X、S、preC、P等mRNA相对表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，进行逆转录，反应体系共20 μL，RNA 2 μL，5×gDNA缓冲液2 μL ,快速逆转录缓冲液2 μL，逆转录酶混合物1 μL，FQ-逆转录随机引物2 μL，无RNA酶的双蒸水11 μL，操作方法参照逆转录试剂盒说明书进行。qRT-PCR反应体系共20 μL：罗氏缓冲液10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，加无菌水至20 μL。qRT-PCR引物序列：X基因上游为5′-TGCGCAGACCAATTTATGC-3′，下游为5′-CTCAGCAATGTCAACGACC-3′；S基因上游为5′-GGTAGGAGCTGGAGCATTCG-3′，下游为5′-GTAGGCTGCCTTCTTGACTG-3′；preC基因上游为5′-GGAGCTACTGTGGAGTTACTCTC-3′，下游为5′-TGTTCAAG CCTCCAAGCTGT-3′；P基因上游为5′-TTGTGG GTCTTTTGGGTTTTG-3′，下游为5′-GTTGGCGAG AAAGTGAAAGC-3′；GAPDH基因上游为5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游为5′-AGGTGGAGGAGTGGGTG-3′。反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，40 ℃ 10 s，共35个循环。样本mRNA Ct值通过GAPDH的Ct值均一化，即ΔCt=Ct样本-Ct内参，样本基因mRNA相对丰度值以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4 蛋白印迹法检测HBc表达 取“1.5.1”细胞，加入上样缓冲液于100 ℃煮10 min，冰上冷却2 min；10 000 r/min、4 ℃离心2 min；行SDS-PAGE，90 V 1 h；200 mA 2 h转印至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1 h；放入一抗稀释液(小鼠HBc抗体，1 ∶1 000)，内参稀释液(兔GAPDH，1 ∶2000)，室温孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；加入二抗(抗小鼠IgG 1 ∶10 000，或抗兔IgG 1 ∶3 000)孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；ECL化学发光试剂盒显色，通过灰度扫描分析各蛋白表达量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 提取物多肽浓度与重金属含量测定

PEST多肽浓度为6.000 mg/mL，PECH多肽浓度为5.600 mg/mL。重金属检测结果表明，PEST、PECH以及细胞培养基中的重金属含量均在机器检测误差范围内，因此重金属含量对细胞造成的影响可以忽略。见表1。

表1 各样本的重金属含量 mg/mL

2.2 PEST和PECH对HepAD38和HepG2细胞无毒性

由图1可见，肝癌HepAD38和HepG2细胞活力在70%以上，各组之间未见显著性差异，表明PEST和PECH对其没有细胞毒性。在HepG2细胞中，48 h时，与对照组相比，0.250和0.500 mg/mL PEST组细胞活力显著升高(t=3.26，3.31，P<0.05)，0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH组细胞活力显著升高(P均<0.05)，与0.125 mg/mL组相比，0.250和0.500 mg/mL PEST组细胞活力显著升高(t=4.67，3.35，P<0.05)；72 h时，与对照组相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST组细胞活力显著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH组细胞活力显著升高(t=2.25，P<0.05)，与0.125 mg/mL组相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST组细胞活力显著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH组细胞活力显著升高(t=4.21，P<0.05)。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与同时间点0.125 mg/mL比较图1 PEST和PECH分别对HepAD38和HepG2细胞活力的影响

2.3 PEST和PECH抑制HBV DNA复制

与对照组相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST组和0.125、0.500、1.000 mg/mL PECH组HBV DNA拷贝数显著降低(P<0.05或<0.01)。由此可见，特定浓度的PEST和PECH可抑制HBV DNA复制，其中1.000 mg/mL浓度作用下HBV DNA拷贝数最小，故选此浓度进行后续抗HBV活性实验。同时，四环素、恩替卡韦和拉米夫定组HBV DNA拷贝数较对照组显著降低(P均<0.01)。见图2。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较图2 不同组HBV DNA拷贝数比较

2.4 PEST和PECH抑制HBsAg和HBeAg含量

与对照组相比，PEST组和PECH组HBsAg含量和HBeAg含量均显著降低(P<0.05或<0.01)。由此可见，PEST和PECH可抑制HBV抗原分泌。同时，四环素、恩替卡韦和拉米夫定组HBsAg含量和HBeAg含量较对照组显著降低(P<0.05或<0.01)。见图3。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较图3 不同组HBsAg和HBeAg含量比较

2.5 PEST和PECH降低HBV P mRNA相对表达

与对照组相比，PEST组和PECH组XmRNA相对表达显著升高(t=11.86，P<0.01；t=4.75，P<0.05)；PEST组和PECH组S和preCmRNA相对表达无明显变化。PEST组和PECH组PmRNA相对表达显著降低(t=6.79，5.12，P均<0.05)；同时，四环素组X、preC和PmRNA，恩替卡韦组和拉米夫定组PmRNA相对表达显著降低(P均<0.05)，拉米夫定组SmRNA相对表达显著升高(P<0.05)。见图4。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较图4 不同组HBV X/S/preC/P mRNA相对表达量比较

2.6 PECH抑制HBc合成

与对照组相比，四环素组、拉米夫定组和PECH组HBc表达量显著降低(P<0.05或<0.01)，恩替卡韦组HBc表达量显著升高(t=22.17，P<0.01)，而PEST组HBc表达量无显著性差异。由此可见PEST对HBc合成几乎无影响，而PECH能抑制其合成。见图5。

M：蛋白分子标准参照物；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较图5 不同组HBV core蛋白表达量比较

3 讨论

全蝎和蜈蚣的毒液是独特的药理资源，其中包含大量具有高度靶向功能的蛋白质和多肽类成分[13]。然而，获取毒液困难且花费高昂，本研究采用的提取多肽方法相对简单且经济。

抗HBV药物也用于与HBV相关的肝细胞癌患者的辅助治疗，显著降低患者体内病毒载量及活跃度，从而延缓病程的进展和复发[14]。HepAD38属于可以分泌HBV的肝癌细胞，HepG2属于肝癌细胞，因此抗HBV作用也可以以细胞毒性的形式表达。PEST和PECH样本中重金属含量在正常范围，本研究分别设置0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL浓度梯度的PEST组和PECH组以探索细胞毒性，结果显示二者对HepAD38和HepG2无细胞毒性。据报道，蜈蚣毒素肽在低浓度下可作为细胞生长因子[15]，据此可以推测PECH类似细胞生长因子在低浓度下促进HepG2细胞生长。同样在HepAD38细胞中探索0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL浓度梯度的PEST组和PECH组对HBV DNA拷贝数的影响。预实验表明，去除四环素后第5天HBV DNA拷贝数约为去除四环素后第2天的53倍，与其他研究一致[16]。由此表明，PEST和PECH可以抑制HBV DNA复制，其中1.000 mg/mL抑制效果最好。

抑制HBV复制必然减少HBsAg和HBeAg的分泌[17]，本研究结果证实PEST和PECH显著抑制HBsAg和HBeAg分泌。此外，PEST和PECH使HBVPmRNA相对表达量显著降低。需要进一步验证P蛋白表达显著降低是否只是由于HBV的PmRNA特异性编码HBV聚合酶[1,18]，没有直接的结构信息可用于P蛋白，但是P蛋白是从pgRNA翻译而来的，pgRNA也可以作为HBc的mRNA，故进一步分析HBc表达，结果表明PECH能抑制HBc表达。

由于多肽类成分分离的复杂性，PEST和PECH样本中多肽成分的分离纯化有待进一步研究。如果分离出有效单体化合物，将更好地发挥全蝎和蜈蚣的抗HBV价值。目前关于PEST和PECH抗HBV活性的研究仅限于HepAD38细胞，还有待于使用动物模型进一步探索。

综上所述，PEST和PECH具有良好的抗HBV活性，可以抑制HBV DNA复制、抑制HBsAg和HBeAg分泌，PECH可以抑制HBc合成。PEST和PECH在HepAD38细胞株中表现出抗HBV作用，可能与PEST、PECH抑制HBVPmRNA合成有关。