LncRNA44372在卵巢癌中的差异表达及生物信息学分析

丁璟, 杨鑫鑫, 邹雪琴， 高淑君， 刘雪， 潘玲丽，张鳅丹， 赵杨静， 梁秀婷，王荟， 朱彦玲， 邵启祥

(1. 江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属徐州医院妇产科， 江苏 徐州 221005)

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200 nt的RNA转录物，具有很少的蛋白编码功能[1]。研究表明，lncRNA与多种生理和病理过程有关，尤其是癌症的发生发展，其异常表达可致癌细胞不受细胞周期调控，无限增殖[2]。lncRNA可从基因的转录前、转录和转录后水平进行调控，还调控DNA甲基化，重构染色质和组蛋白甲基化、乙酰化等表观遗传[3]。lncRNA常见的作用机制是通过海绵体吸附某些miRNA从而影响下游靶mRNA，构成竞争性内源RNA网络，从而调控基因的表达和功能的发挥[4]。但是，lncRNA在卵巢癌中发挥的生物学作用尚不清楚。本研究通过GEO数据库筛选获得在卵巢癌中具有显著差异表达的lncRNA44372，其位于chr6:165773201-165773271。进一步采用生物信息学技术对其生物学作用进行预测分析，并运用定量PCR验证其在卵巢癌细胞中的表达水平。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂与仪器

人卵巢癌细胞系HO8910，3AO，A2780，OVCR3以及卵巢上皮HOSEpiC细胞由江苏大学医学院周小明教授惠赠；人卵巢癌SKOV3细胞由江苏大学医学院卢小东教授惠赠。

DMEM，RPMI 1640，胎牛血清购于美国Gibco公司；Trizol 试剂购于宝日医生物技术(北京)有限公司；异丙醇、氯仿、无水乙醇购自上海国药集团化学试剂有限公司；逆转录试剂盒、PCR ExTaqDNA聚合酶和SYBR©Premix ExTaqTMⅡ购自宝日医生物技术(北京)有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水购于上海生工生物工程有限公司；实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；NanoDrop1000测定仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 下载数据库 从NCBI GEO(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中下载基因芯片数据集。进入NCBI网站，找到“GEO DataSets”搜索关键词“ovarian tissue samples”，“normal”，“tumor”，点击“search”，下载基因表达谱芯片数据GSE119054。它的基因芯片平台是GPL19615 Agilent-067406 CBC lncRNA + mRNA microarray V4.0。

1.2.2 筛选在卵巢癌中差异表达的lncRNA 在肿瘤转录组数据库CRN(http:∥syslab4.nchu.edu.tw/index.jsp)中对来自NCBI GEO数据库中卵巢癌及正常组织样本数据分析，以P<0.05，差异倍数1.2倍以上为条件，筛选出在卵巢癌中表达上调和下调的lncRNA。

1.2.3 筛选与lncRNA44372作用的相关基因 通过在线工具Annolnc(http:∥annolnc.cbi.pku.edu.cn/)[5]筛选出可能与lncRNA44372表达水平相关的基因，并用互作分数来表示共表达的强度。

1.2.4 lncRNA44372的GO分析和信号通路分析 利用在线工具David[6-7](https:∥david.ncifcrf.gov)对筛选出的共表达基因进行基因本体论分析(gene ontology，GO)及信号通路分析。

1.2.5 lncRNA44372的竞争性内源RNA网络构建 通过在线工具starbase(http:∥starbase.sysu.edu.cn/)研究lncRNA44372可靶向的miRNA分子和下游靶mRNA分子。利用在线数据库GEPIA(http:∥gepia.cancer-pku.cn)研究靶mRNA分子在卵巢癌中的表达量。

1.2.6 细胞培养 将卵巢癌SKOV3，HO8910，OVCR3和3AO细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养，卵巢上皮细胞癌A2780细胞和卵巢上皮HOSEpiC细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。

1.2.7 RNA提取 取对数生长期的“1.2.6”细胞，以1×105密度接种于6孔板中，待细胞长至汇合度80%时取出；弃去培养基，用预冷PBS洗涤2次；每孔加入1 mL Trizol 试剂，在冰上静置5 min；用微量移液器小心吹打细胞使其脱落并转移至1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，上下颠倒混匀5次，静置5 min；于4 ℃ 12 000×g离心15 min；取上清液，加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀5次后静置5 min；于4 ℃ 12 000×g离心10 min；弃上清液，每管加入75%乙醇1 mL漂洗沉淀；于4 ℃ 7 500×g离心5 min；弃去上清液后室温干燥，每管加入适量DEPC水溶解RNA，用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度和纯度。

1.2.8 逆转录反应 根据逆转录试剂盒说明书将提取的总RNA逆转录成cDNA。反应条件：37 ℃反应15 min， 85 ℃反应5 min，4 ℃得到cDNA，保存于-20 ℃备用。

1.2.9 实时荧光定量PCR检测lncRNA44372表达 引物设计采用Primer 5.0软件，β-肌动蛋白上游引物序列为5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列为5′-ATACTCCTGCTTGCTGATC-3′；lncRNA44372上游引物序列为5′-TATTGCACTTGGACGGAGCA-3′，下游引物序列为5′-AAGGCAAGCAACTTGACACG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA 0.5 μL为模板，上下游引物各0.2 μL，SYBR Premix ExTaqTMⅡ5.0 μL，灭菌水4.1 μL，配制10 μL反应体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样本设置3个复孔，根据熔解曲线形态判断反应的特异性，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 卵巢癌中差异表达的lncRNA

在肿瘤转录组数据网站CRN中对来自NCBI GEO数据库中有关的卵巢癌样本结果分析，其中根据表达量差异及P值发现，与卵巢正常组织相比，卵巢癌组织中表达上调的lncRNA有CROCCP2，lncRNA 00883，lncRNA00704，MCM3AP-AS1，DLEU2，NBLA00301；表达下调的lncRNA有lncRNA44372，lncRNA00657，RP11-890B15.3，TP73-AS1，差异具有统计学意义(P<0.05)。本实验室前期芯片检测结果[7]发现，在卵巢癌细胞系中有227个lncRNA表达上调，有483个lncRNA表达下调；结合基因表达谱芯片数据GSE119054选择lncRNA44372作为研究对象。

2.2 与lncRNA44372作用相关的共表达基因的筛选结果

根据相关作用分数及P值<0.05，筛选出与lncRNA44372存在相互作用关系的基因有579个。根据相关作用分数对579个基因进行排序，筛选出最具有相关性的10个基因(表1)。这些基因的功能主要涉及蛋白激酶活性、细胞凋亡、细胞周期等。

表1 相关性显著的10个基因

2.3 与lncRNA44372共表达基因的GO分析

对579个相关基因和lncRNA44372进行GO分析(表2)。结果显示，共表达基因在生物过程中富集在细胞周期调控、细胞转运、细胞骨架调控、细胞迁移、蛋白肽调节等方面；分子功能主要富集在信号传感器活性的调节、MHCⅡ类受体分子的活性、GTP酶激活剂活性、蛋白苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白结合能力等方面。见图1。

表2 相关基因的GO分析

图1 相关基因的GO分析

2.4 与lncRNA44372共表达基因的信号通路分析

信号通路富集分析表明，lncRNA44372可以在肿瘤坏死因子受体及其介导的细胞凋亡途径、p75神经营养因子受体介导的细胞凋亡通路，神经生长因子及其受体酪氨酸激酶A介导的肿瘤发生、增殖、血管生成和转移等相关途径发挥作用。

2.5 lncRNA44372的竞争性内源RNA网络构建

生物信息学在线工具starbase分析发现lncRNA44372可靶向的miRNA分子有miR-190和miR-193，相关的下游靶mRNA分子有UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2等(图2 A)。通过GEPIA数据库预测靶mRNA分子在卵巢癌中的表达，结果显示与正常样本相比，ULK2分子(t=2.43，P<0.05)和LONP2分子(t=2.49，P<0.05)在卵巢癌中表达明显降低(图2B)。

2.6 lncRNA44372在卵巢癌细胞的表达

qRT-PCR检测结果显示，与卵巢正常HOSEpiC细胞相比，lncRNA44372在卵巢癌细胞A2780(t=13.18，P<0.01)，SKOV3(t=12.82，P<0.01)，HO8910(t=5.36，P<0.05)，OVCR3(t=5.19，P<0.05)，3AO(t=4.73，P<0.05)中表达明显下调，且与生物信息学结果一致。见图3。

A:竞争性内源RNA网络构建; B: ULK2和LONP2在卵巢癌组织及正常组织中的表达图2 竞争性内源RNA网络及靶mRNA在卵巢癌组织和正常组织中的表达

a：P<0.05，b: P<0.01，与HOSEpiC细胞比较图3 lncRNA44372在卵巢癌细胞系和卵巢正常细胞中的表达

3 讨论

本研究首先通过NCBI GEO数据库筛选出在卵巢癌中表达具有差异意义的lncRNA44372，并进一步分析与其相关的基因。GO分析和信号通路分析结果显示，lncRNA44372可能与调控细胞迁移、侵袭变化，细胞周期改变，细胞骨架蛋白调控，蛋白苏氨酸/酪氨酸激酶活性的调节等有关。

研究表明，细胞迁移和侵袭变化可促进肿瘤细胞的上皮间质转化过程[8]，促进肿瘤转移；细胞周期失控可以使得肿瘤细胞不接受抑制信号，持续增殖[9]；细胞骨架蛋白Rho经GDP激活后，可以与下游分子结合使得细胞骨架重排。有文献指出，lncRNA PCGEM1可以通过上调RhoA表达促进卵巢癌的发展[10]。此外，苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性对肿瘤细胞的迁移具有调控作用。例如，lncRNA-BANCRY通过激活苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶，从而通过调节细胞自噬来抑制甲状腺癌细胞增殖[11]。但是，lncRNA44372在上述生物学过程中发挥的作用尚需进一步研究。

通过生物信息学预测，lncRNA44372可能与miR-190，miR-193及下游UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2的靶mRNA分子构成竞争性内源RNA网络。在该网络中，与正常组织相比，lncRNA44372呈低表达且像海绵体一样吸附靶miRNA分子，而被吸附的miRNA分子可负向调控靶mRNA分子。因此，只有在卵巢癌中下调表达的mRNA分子才可能发挥作用。

研究发现，ULK2分子在卵巢癌中呈低表达，其主要作用是编码丝氨酸/苏氨酸激酶，并且可以调节细胞代谢和自噬途径[12]，该发现与本研究中GO分析结果相一致。此外，LONP2分子同样在卵巢癌中呈低表达。有研究发现，LONP2 在宫颈癌中通过氧化应激促进子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭[13]。因此推断，lncRNA44372可能与miR-190，miR-193及ULK2和LONP2构成竞争性内源RNA网络。此外，在细胞水平证实lncRNA44372在卵巢癌中呈低表达，与生物信息学预测结果一致。

综上所述，lncRNA44372在卵巢癌组织中呈低表达，可能通过影响卵巢癌细胞凋亡、细胞周期和细胞蛋白激酶活性等促进卵巢癌发展。