自拟调气汤对顺铂诱导的大鼠肾损伤的影响及其机制

李小兰， 王韶军， 马跃飞， 王琳琳

(1. 张家口市中医研究所附属医院肾内科，河北 张家口 075000 ； 2. 河北北方学院附属第一医院肾内科，河北 张家口 075000)

顺铂是目前治疗肿瘤的常用化疗药物，但由于其具有明显的肾毒性，导致其在临床应用中受限[1]。Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路是与机体组织细胞炎症损伤相关的重要信号通路[2]。研究证实，TLR4异常激活能够促进体内炎症因子的产生，进而激活NF-κB通路及促进相关蛋白表达，而NF-κB通路激活后在炎症因子的作用下又进一步加重体内炎性反应[3]。研究表明，肾损伤的发病机制及疾病转归与TLR4/NF-κB通路及相关蛋白的表达密切相关[4]。调气汤是以中医基础理论为指导自拟的一种中药方剂，其内部成分有降压、降肌酐等作用，但关于其对肾脏炎症，尤其是对化疗药物诱发的肾毒性的作用尚不清楚。因此，本研究拟通过构建顺铂诱导大鼠急性肾损伤动物模型，探讨调气汤对肾功能的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器

清洁级雄性SD大鼠90只，8周龄，体重180～200 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001，适应性饲养1周。本研究经张家口市中医研究所附属医院伦理委员会批准(伦理编号20180012)。

自拟调气汤(由党参20 g，白术15 g，茯苓15 g，陈皮10 g，清半夏10 g，莱菔子15 g，紫苏叶12 g，砂仁10 g，鸡内金15 g，佩兰15 g，黄连12 g，丹参15 g，川芎15 g，白茅根30 g，酒大黄10 g，土茯苓30 g，川牛膝15 g组成)，由药材饮片制成每毫升含5 g生药的制剂(张家口市张垣饮片厂)；顺铂注射液(杭州民生药业集团有限公司)；氨磷汀(美罗药业股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛含量检测试剂盒，TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA检测试剂盒，RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒，兔抗大鼠TLR4、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠GAPDH抗体和HRP标记山羊抗兔IgG 均为碧云天生物科技有限公司产品；HE染液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

CX23显微镜(日本Olympus公司)；Microfuge 20离心机(美国Beckman Coulter公司)；MB-580多功能酶标仪(深圳市汇松科技发展有限公司)；ChemiDoc XRS型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；AU5800全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司)；石蜡切片机(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；DYCZ-30C双垂直电泳槽(北京海天友诚科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 肾损伤大鼠模型建立及分组处理 按照随机数字表法将大鼠分为正常对照组，模型组，调气汤低、中、高剂量组及阳性对照组，每组15只。除正常对照组外，参照文献[5]，于动物尾静脉注射顺铂(2.5 mg/kg)，1次/d，连续5 d，建立肾损伤大鼠模型。大鼠血清尿素氮、肌酐含量较正常对照组显著升高(P<0.05)及肾组织病理学改变视为造模成功。根据临床给药剂量按照体表面积换算，分别按照2、4、8 mL/kg剂量予以调气汤低、中、高剂量组大鼠调气汤灌胃，阳性对照组予以腹腔注射氨磷汀(1 mg/kg)[6]，正常对照组及模型组给予生理盐水(2 mL/kg)灌胃，1次/d，连续给药60 d。

1.2.2 标本采集及处理 各组给药结束后24 h，予以1%戊巴比妥钠腹腔注射(50 mg/kg)麻醉大鼠。每组各取6只大鼠，于腹主动脉取血5 mL，以4 ℃，3 500 r/min离心10 min，取上层血清用于检测肌酐、尿素氮；取脾脏和肾脏组织，分别置于玻璃匀浆器中，加入4 ℃预冷的生理盐水，充分匀浆后，3 500 r/min离心10 min，取上清液用于检测炎症因子、SOD和丙二醛含量；另外每组各取6只大鼠肾脏，在玻璃匀浆器中加入RIPA蛋白裂解液进行匀浆，以4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液行蛋白免疫印迹检测；其余每组3只大鼠取肾脏组织作切片行HE染色。

1.2.3 比色法检测血清相关指标 取“1.2.2”血清，用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清尿素氮和肌酐含量。按照试剂盒说明书分别用比色法和显色法检测肾组织SOD活性和丙二醛含量。

1.2.4 ELISA检测肾组织和脾脏炎症因子含量 取“1.2.2”大鼠肾脏和脾脏上清液。96孔板设置空白孔、标准孔、待测样品孔。标准孔和待测样品孔分别加入标准品或待测上清液100 μL，空白孔不加样；室温反应2 h；弃液、洗孔，每孔加生物素化抗体100 μL，室温反应1 h；弃液、洗孔，每孔加HRP标记的亲和素100 μL，室温反应1 h；弃液、洗孔，每孔加入TMB溶液100 μL，室温避光显色30 min左右，至肉眼可见标准品孔呈现明显的梯度蓝色；每孔依次加入终止液50 μL，见蓝色转为黄色；用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(D)值；计算样品浓度。

1.2.5 肾组织HE染色 取肾组织，10%中性甲醛中固定24 h，乙醇脱水、二甲苯透明各5min，浸蜡、包埋、5 μm切片，经过二甲苯、乙醇脱蜡至水，随后苏木素染3 min，1%盐酸乙醇分化5 s，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；伊红染色2 min；梯度乙醇和二甲苯脱水透明，切片晾干，中性树胶封片；于显微镜下观察肾组织病理改变。

1.2.6 蛋白免疫印迹检测肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平 取“1.2.2”采集肾组织上清液，100 ℃水浴5 min变性；BCA法测定蛋白浓度；取50 μg蛋白进行SDS-PAGE。浓缩胶用恒压80 V进行电泳，当电泳至分离胶后改为120 V继续进行电泳；350 mA恒流转膜1 h；PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入兔抗大鼠TLR4(1 ∶300)、NF-κB(1 ∶200)及GAPDH抗体(1 ∶500)4 ℃孵育过夜；PBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h；PBST再次清洗3次；进行发光、显影，拍照，凝胶图像系统处理；用Image J 1.52v软件进行灰度值检测及分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 调气汤对大鼠血清尿素氮和肌酐含量以及肾组织病理的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清尿素氮和肌酐均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，调气汤各剂量组及阳性对照组血清尿素氮和肌酐显著降低(P<0.05)，且随着调气汤剂量增加，血清尿素氮和肌酐含量逐渐降低。见表1。HE染色结果显示，正常对照组肾组织结构正常，组织细胞排列整齐，未见明显病理学改变；模型组肾组织出现明显病理学改变，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞脱落，肾间质可见大量炎性细胞浸润，组织细胞坏死、脱落，肾间质表现出纤维化病理性改变；与模型组相比，调气汤各剂量组及阳性对照组大鼠肾组织病理变化明显改善，肾小球萎缩和肾小管上皮细胞脱落减少，肾间质纤维化明显减轻，炎症细胞浸润减少。见图1。上述结果提示肾损伤大鼠模型造模成功，且调气汤可改善肾功能和减轻肾组织损伤。

表1 各组大鼠血清尿素氮、肌酐含量比较

图1 各组大鼠肾组织病理学表现(HE×200)

2.2 调气汤对大鼠肾组织炎症因子和氧化应激水平的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组比较，调气汤各剂量组及阳性对照组TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高 (P<0.05)，且随着调气汤剂量的增加，TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量逐渐降低，SOD活性逐渐升高。见表2。

表2 各组大鼠肾组织炎症因子和氧化应激标志物含量比较

2.3 调气汤对大鼠脾脏细胞因子水平的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠脾脏TNF-α、IL-17及MMP-9含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，调气汤各剂量组及阳性对照组大鼠TNF-α、IL-17及MMP-9含量显著降低(P<0.05)，随着调气汤剂量增加，TNF-α、IL-17及MMP-9水平逐渐降低。见表3。

表3 各组大鼠脾脏细胞因子含量比较

2.4 调气汤对大鼠肾组织TLR4和NF-κB蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织TLR4和NF-κB蛋白表达水平显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，调气汤各剂量组及阳性对照组TLR4和NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，且随着调气汤剂量增加，肾组织TLR4和NF-κB蛋白表达水平逐渐降低。见图2。

① 正常对照组；② 模型组；③ 调气汤低剂量组；④ 调气汤中剂量组；⑤ 调气汤高剂量组；⑥ 阳性对照组。a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较；c：P<0.05，与调气汤低剂量组比较；d：P<0.05，与调气汤中剂量组比较

3 讨论

顺铂是目前临床常见的一种引起肾损害的药物[7]。丙二醛是脂质过氧化中最丰富的活性醛，是细胞损伤的重要信号分子，作为细胞和组织氧化应激的指标[8]，而SOD是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，能够防止机体组织细胞过度氧化损伤，其水平的降低提示机体自我修复能力下降。TNF-α、IL-6、IL-1β是体内敏感的炎症信号分子，当机体出现不同程度的炎症反应时，其水平则会显著升高[9]。本研究中各剂量调气汤组肾组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、丙二醛水平较模型组降低，SOD升高，并且呈剂量依赖性，提示调气汤对顺铂诱导的肾脏炎症和氧化应激有改善作用。

此外，顺铂的毒性作用可造成肾脏明显损伤，出现尿量减少，血肌酐、尿素氮水平增高。肾组织镜下形态学表现为炎症细胞增加，甚至纤维化。本研究给予肾损伤大鼠调气汤干预后，随着给药剂量增加，肾功能有所恢复，肌酐、尿素氮水平降低，且肾脏病理中炎症细胞浸润减少，肾小球纤维化较模型组动物明显减轻，证实调气汤对肾脏有保护作用，可明显改善肾功能，缓解纤维化。

TLR4是TLR蛋白家族的主要成员之一[10]，与机体组织炎症密切相关[11]，其异常激活是诱导肾脏损伤的重要因素[12]。NF-κB是与炎症因子信号传递相关的信号通路，该通路及上下游相关蛋白的激活能够促进机体炎症反应加重[13]。前期研究发现，大鼠急性肾损伤的发生与TLR4/NF-κB通路的异常激活密切相关，抑制TLR4/NF-κB通路能够改善大鼠肾功能，缓解肾组织损伤[14]。本实验结果表明，给予不同剂量调气汤后，肾损伤大鼠肾组织TLR4和NF-κB蛋白表达水平显著降低，提示调气汤在一定剂量范围内能够呈剂量依赖性抑制TLR4/NF-κB通路的过度激活，从而发挥其肾组织保护作用。

综上所述，自拟调气汤能够降低顺铂诱导的肾损伤大鼠肾组织炎症因子含量，缓解肾组织氧化应激损伤，改善肾功能及肾组织病理变化，其机制可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。