三种结核分枝杆菌检测方法在高原地区临床实验室中的应用

赵文君，李子安

(青海省人民医院医学检验科，青海省检验医学重点实验室，青海省医学检验临床医学研究中心，青海 西宁 810007)

肺结核是世界范围内单病因致死率较高的疾病之一，由耐酸结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道传染性疾病[1]。由于高原地区高寒缺氧紫外线强等特殊地理环境，特别是在高海拔地区地广人稀，交通不便利，医疗设施卫生条件落后，相当一部分患者就诊不及时，治疗不正规[2]。高原部分地区海拔高度3 000米以上,具有低压低氧、寒冷、干燥、昼夜温差大、辐射强度高等高原环境特点，对人体免疫系统功能可造成不同程度的影响，低氧环境可引发肺纤维化形成，肺血管重新分布，呼吸系统疾病成为高原地区的常见病、多发病，特别是在免疫机能低下的老年人中肺结核发病率呈明显的上升趋势[3]。高原地区成为结核病高发地区，近年来随着国家的发展，高原地区卫生医疗条件的改善，各级医院集中开展防治工作，有效降低了结核病发病率和死亡率，但结核分枝杆菌预防与检测仍是诊断重点和难点[4-5]，肺结核实验室诊断主要有病原学方法、免疫学检测方法和分子生物学方法三类[6]，病原学方法学检测包括涂片抗酸染色法、培养法；免疫学检测主要是进行结核抗体检测，蛋白芯片法也是以结核分枝杆菌特异性抗体检测为基础；分子生物学检测主要有荧光定量PCR技术和芯片杂交[7]。传统的涂片抗酸染色法和培养法在结核病实验诊断上是金标准，但存在培养时间长、影响因素多，阳性率不高等诸多局限。

1 资料与方法

1.1一般资料：本次研究所采用标本来源于2018年3月～2019年12月青海省人民医院临床送检痰样本。将临床表现为发热，乏力、消瘦、盗汗等，出现咳嗽、咯痰的时间长达14天以上或咳出带血痰液等可疑症状患者分组[8]，疑似肺结核组190例，肺结核组60例，非结核组50例。每组纳入资料根据病史、临床表现、影像学和实验室诊断差异无统计学意义(P>0.05)。肺结核诊断，标本的采集、运送和保存按《肺结核诊断标准》[9](WS 288-2017)执行。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2仪器与试剂：美国公司QuantStudio5荧光定量PCR仪；苏净集团安泰公司B2型生物安全柜；日本奥林巴斯株式会社生产的CX-31生物显微镜；台湾贝索商品化抗酸染色液；博慧斯生物医药科技有限公司提供改良罗氏培养基；湖南圣湘生物科技公司提供结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。实验室所用所有试剂、 耗材均在有效期内，并按说明书进行操作和使用。

1.3方法

1.3.1痰涂片抗酸染色：采用最经典的萋尼抗酸染色法，按照《痰涂片镜检查标准化操作及质量保证手册》[10]进行标本处理、涂片、染色、镜检操作，用 100×油镜观察，结核分枝杆菌在蓝色背景下呈细长略弯曲的红色杆菌。

1.3.2改良罗氏培养基：按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》培养痰液标本处理、培养及鉴定，使用大肠埃希菌(ATCC 25922)作为阴性质控，结核分枝杆菌质控菌株H37Ra作为阳性质控，有菌落生长并经萋尼抗酸染色法验证后报告结核分枝杆菌培养阳性。发现有非结核分枝杆菌生长时报告污染，本次研究使用改良罗氏培养基培养时未发现有非结核分枝杆菌生长。

1.3.3TB-DNA PCR操作：按照结核分枝杆菌核酸检测试剂盒说明书进行标本前处理和检测，通过QuantStudio5荧光定量 PCR 仪进行结果判定。

2 结果

2.1三种检测方法对190例疑似肺结核患者检测结果比较：涂片抗酸染色法、改良罗氏培养基培养法、TB-DNA PCR 检测190例疑似肺结核患者痰液标本的阳性率分别为 13.2%、39.5%、47.4%。TB-DNA PCR 阳性率高于改良罗氏培养基培养法，差异有统计学意义(P<0.05)，改良罗氏培养基培养法高于涂片抗酸染色法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 190例疑似肺结核患者痰液标本阳性率比较

2.2三种检测方法对60例肺结核患者及50例非结核病患者检测结果比较：三种方法检测60例肺结核患者阳性例数分别为10例、28例、51 例，检测50例非结核病患者阳性例数分别为0例、8例、12例。

2.3三种检测方法诊断效能：三种方法在检测60例肺结核患者及50例非结核患者中，TB-DNA PCR灵敏度高于改良罗氏培养基培养法，改良罗氏培养基培养法灵敏度高于涂片抗酸染色法，灵敏度分别为85.0%，46.7%，16.7%，三种检测方法的阳性预测值分别为80.9%，77.8%，100%，阴性预测值分别为80.8%，58.4%，50.0%，从三种方法学正确度比较，TB-DNA PCR正确度最高为80.9%，其次为改良罗氏培养基培养法和涂片抗酸染色法。见表2。

表2 三种检测方法诊断效能(%)

3 讨论

痰液中结核分枝杆菌检测，是发现结核病传染源的主要途径和手段，它对结核病诊断确认、传染源控制、治疗方案的确定和疗效评估具有十分重要的意义。结核分枝杆菌检测方法中比较传统也是应用最广的涂片抗酸染色法和改良罗氏培养基培养法。涂片抗酸染色法由于其操作简单、成本低、不需要特殊仪器、易推广、简单快速等优点在基层实验室得到广泛的应用，仍然是一种经济的检测方法。此研究内容中涂片抗酸染色法与改良罗氏培养基培养法和TB-DNA PCR法比较，其检测灵敏度低(16.7%)，特异性高(100%)，与国内文献报到基本一致[11-12]。涂片抗酸染色法需要痰液中有一定数量的结核分枝杆菌才能检出[13]，在疑似肺结核患者痰液标本检测中阳性率低(13.2%)，与其他两种检测方法差异有统计学意义(P<0.05)。改良罗氏培养基培养法是检测结核分枝杆菌的金标准[14]，但是由于检测周期长，一般需要3～8周，从而影响结核病的诊断和治疗，因此这两种结核分枝杆菌的检测方法都存在较大的缺陷。

近年来，分子生物学检测方法的迅速发展和推广很好地弥补了传统结核分枝杆菌检测方法的缺陷。结核分枝杆菌DNA荧光定量PCR法都是通过PCR技术为基础进行定量检测结核分枝杆菌的DNA，实验数据表明，对190例疑似肺结核患者痰液标本进行检测，TB-DNA PCR检测阳性率(47.4%)明显高于传统改良罗氏培养基培养法(39.5%)及涂片抗酸染色法(13.2%)，检测结果具有统计学差异，对肺结核确诊患者痰液标本检测灵敏度(85.0%)明显高于涂片抗酸染色法(16.7%)和改良罗氏培养基培养法(46.7%)，特异性也能够满足检测需要，TB-DNA 检测法阳性预测值(80.9%)明显高于改良罗氏培养基法(77.8%)，阴性预测值(80.8%)明显高于改良罗氏培养基法(58.4%)和涂片抗酸染色(50.0%)。PCR检测法的诊断率最高(80.9%)，相比传统的涂片抗酸染色和改良罗氏培养基培养法，TB-DNA PCR分子生物学检测方法均为敏感、特异、快速、可靠的检测方法[15]。越来越多的实验室检测技术被发展，都有各自优势，现代的分子生物学方法仍然无法代替传统的结核诊断方法，临床医生需要联合运用，不断发展更高性价比的检验技术才能对结核感染进行快速、准确的诊治[16]。