生姜提取物6-姜酚调节生长因子促进创面愈合的机制

侯 春，王肃生，梁 刚，张志华，冀 航，王平平，施 然，李伯辉

0 引 言

姜酚中又以6-姜酚含量最高，其生物活性也最强。作为生姜中的主要药物活性成分，已证实6-姜酚具有多种药用价值，如健胃与抗胃溃疡作用，强心作用，消炎作用，对中枢神经抑制作用，抗氧化作用，抗肿瘤作用等[1]。

皮肤的创面愈合是一个十分复杂的生物过程，涉及机体诸多变化[2-3]。伤口愈合过程中，相关细胞分泌的细胞生长因子如转化生长因子β1(transforming growth factor- 1，TGF-β1)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、胰岛素样生长因子-Ⅰ (insulin like growth factor, IGF)，细胞增殖相关因子如增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)，α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)等均能够促进细胞的生长和分化，对创面愈合具有决定性作用[4-7]。胶原蛋白在伤口愈合过程中的沉积和收缩有重要的作用。羟脯氨酸是胶原的主要成分，其所占比例相对恒定，测定羟脯氨酸的含量便可反应胶原的水平。

姜酚已经被证实具有抗氧化和抗炎作用等属性，并有助于促进新血管形成[8]。有研究表明生姜复合物可能有助于改善皮肤伤口愈合，姜黄素和生姜提取物同时干预皮肤创面能够改进皮肤结构和功能，这对促进皮肤愈合具有积极作用9-10]。目前关于6-姜酚对伤口愈合的治疗和作用机制研究较少，本文通过对于生姜提取物6-姜酚的体内动物实验研究，探究生姜提取物6-姜酚对小鼠创面愈合的影响，该研究可为6-姜酚用于皮肤创面愈合提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性C57BL/6小鼠共20只，8～12周龄，体重18～23 g，购自广州源生医药科技有限公司，实验动物合格证号:SYX(粤)2015-0150。所有动物在温度控制的动物设施中以12 h的明暗周期适应至少1周，温度23～25 ℃，相对湿度40%～70%，并喂以标准的小鼠颗粒饲料和水。

1.1.2实验试剂生姜提取物6-姜酚(上海远慕生物科技有限公司)；PDGF，VEGF，TGF-β1，GAPDH引物(上海生工生物工程股份有限公司)；PDGF，VEGF，TGF-β1，PCNA，α-SMΑ，GAPDH抗体(Cell Signaling Technology)；其他有机分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2建立动物模型和分组将8～12周的C57BL/6小鼠采用随机数字表法分成正常组、6-姜酚治疗组[局部注射6-姜酚，30 mg/(kg·d)], 每组10只。所有小鼠适应性喂养1 周后，小鼠吸入异氟醚麻醉，在小鼠背部区域剃毛后沿着脊柱两侧分别做2个8 mm直径的全皮肤缺损创伤面，用半透膜覆盖创面防止其干燥。小鼠均进行局部注射，其中正常组注射等量等渗盐水。实验第5天取小鼠皮肤组织标本，将小鼠左侧皮肤用于HE和免疫组化检测，右侧皮肤立即冻存于80 ℃用于蛋白质和mRNA水平表达检测。

1.3观察指标

1.3.1 伤口愈合状况测定建模后第 1、3、5、7天在相同条件下记录小鼠局部创面愈合情况，对记录照片使用Image J 软件统计伤口面积。以术后原始伤口面积为基准，计算伤口愈合率，公式如下：

伤口愈合率=未愈合伤口面积/原始伤口面积×100%

1.3.2HE染色及免疫组织化学检测小鼠建模后连续给药，实验第5天颈椎脱臼处死小鼠，取创面及周围1 cm皮肤组织，固定于4%多聚甲醛，制作石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察并拍照。另取组织切片脱蜡、水化、抗原修复、封固、一抗孵育(PCNA，α-SMΑ，CD31)、二抗孵育、DAB显色试剂盒显色、苏木精复染、盐酸乙醇分化、脱水、透明、封固、镜检、免疫组织化学切片拍照。

另取组织切片脱蜡、水化，使用蒸锅在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中对样品进行抗原回收。用一抗(MPO，F4 / 80) 抗体对切片进行染色、4 ℃过夜，然后与二抗一起孵育， 并用 DAPI(40，6- 二 mid 基 -2- 苯基吲哚)染色。使用荧光显微镜对染色的样品成像。在 40 倍放大倍数下， 在4个随机选择的高倍镜视野中对伤口边缘区域的角质形成细胞或成纤维细胞标记染色进行计数并取平均值。

1.3.3Western blot检测目的蛋白取冻存的皮肤组织样本，丙酮清洗3次后于通风橱中晾干，取适当体积组织加入含十二烷基硫酸钠的蛋白缓冲液进行组织匀浆，4 ℃ , 12 000 r/min 离心 10 min 后收集上清蛋白液。采用 BCA 蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度，制作SDS-PAGE胶进行电泳分离蛋白质，并将蛋白转移至NC膜。常温进行封闭，4 ℃过夜孵育一抗(PDGF、VEGF、TGF-β1、PCNA、α-SMΑ、GAPDH)，第2天室温孵育二抗1 h，最后加入底物并曝光、显影成像。

1.3.4Real-time PCR检测mRNA表达TRizol法提取伤口组织总RNA，反转录得到cDNA。设计合适的引物，见表1。按照荧光定量PCR试剂盒(Gibco-赛默飞)完成扩增反应，完成后进行熔解曲线制作。结果以 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3.5羟脯氨酸含量的测定取术后第5天小鼠创面表皮作羟脯氨酸含量检测。根据Hydroxyproline Assay试剂盒的操作步骤进行操作，在550 nm 波长处测量吸光度；根据说明书公式计算出相应的羟脯氨酸含量，每组设3个复孔，实验重复3次。

2 结 果

2.1 实验小鼠创面愈合率术后第1天，6-姜酚治疗组小鼠创面呈鲜红色圆形无伤疤，创周清晰整齐。术后第3天，正常组小鼠创面边缘开始模糊，6-姜酚治疗组小鼠背部创面颜色开始加深，创面缓慢缩小，创缘处可见结痂。术后第5天，正常组创面缩小，颜色加深呈深褐色，6-姜酚治疗组伤口面积显著缩小，创面结痂覆盖，愈合面积增大。见图1。

与正常组同时间点比较，*P<0.05

2.2实验小鼠创面病理变化实验第5天，正常组创面肉芽组织较少，可见少量毛细血管。与正常组相比，6-姜酚治疗组创面肉芽组织更为丰富，有较多成纤维细胞及新生毛细血管。正常组上皮间隙(1.68±1.17)较6-姜酚治疗组(0.77±0.43)更大(P<0.05)。见图2。

a:正常组； b:6-姜酚治疗组

2.3愈合创面组织免疫组化变化创伤形成第5天，免疫组化分析显示，在皮肤结构内观察到了PCNA的定位，正常组创面组织中PCNA、α-SMΑ、CD31蛋白表达较低。6-姜酚治疗组PCNA、α-SMΑ、CD31蛋白较正常组显著提高(P<0.05)。表明上皮细胞和皮肤基底细胞核具有更快的再发率。见图3，表2。

图3 术后第5天小鼠创面皮肤组织中正常组与6-姜酚治疗组的PCNA、α-SMΑ、CD31形态(免疫组化染色 ×40)

表2 术后第5天小鼠创面的PCNA、α-SMΑ、CD31阳性表达水平

2.4愈合创面组织免疫组织荧光变化创伤形成第5天，免疫荧光分析显示，创面组织中F4/80表达较低。6-姜酚治疗组F4/80、MPO较正常组显著提高(P<0.05)。表明在6-姜酚药物影响下，巨噬细胞在创面修复中具有一定的作用。见图4，表3。

图4 术后第5天小鼠创面皮肤组织中MPO和F4/80形态(免疫荧光染色 ×40)

表3 术后第5天小鼠创面的MPO、F4/80阳性表达水平

2.5创面组织中相关因子蛋白表达和mRNA表达与分布创伤形成第5天，与正常组相比，6-姜酚治疗组创面组织中PDGF、VEGF、TGF-β1、PCNA、α-SMΑ蛋白和基因表达均明显高于正常组。见图5、图6。

2.6羟脯氨酸含量的测定本实验术后5 d，6-姜酚治疗组小鼠羟脯氨酸含量(3.51±1.04)较正常组(2.31±0.84)显著提高(P<0.01)。

1：正常组； 2：6-姜酚治疗组

*P<0.05、**P<0.01

3 讨 论

姜酚是生姜中主要辣味物质，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等十余种成分，这些成分分子结构类似，是姜的主要生物活性成分。6-姜酚具有消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[11]，但6-姜酚在伤口愈合过程中起到的保护作用及分子机制仍不明确。

在健康和患病状态下，胶原蛋白都是生物学上重要的蛋白质。胶原蛋白是人体中最丰富的蛋白质，对于维持骨骼，皮肤，软骨和血管等结缔组织的正常结构和强度至关重要[12]。胶原是创面组织中的主要基质成分，目前胶原已分为19种类型，但皮肤组织中主要含有I、Ⅲ、Ⅳ型胶原。胶原合成是创面愈合过程的主要特征，同时又是细胞外基质的主要蛋白质成分。胶原作为细胞生长的依附和支持物，能诱导上皮细胞等的增殖、分化和移行，且胶原纤维具有弹性，能减少创面的收缩。由于胶原成分中羟脯氨酸的含量(约13.4%)较为固定， 因而，创面组织中羟脯氨酸的含量可以直接反映出其胶原的含量，进而羟脯氨酸能反映结缔组织疾病中的胶原蛋白代谢情况[13-14]。本实验结果显示术后第5天，6-姜酚治疗组能够显著增强创面羟脯氨酸的表达，这对促进皮肤愈合具有一定的帮助。

本研究初步探索了6-姜酚在组织创伤愈合过程中的分子作用机制，6-姜酚治疗组PDGF、 VEGF、TGF-β1基因及蛋白表达较正常组显著增加，且6-姜酚治疗具有促进PCNA、α-SMΑ表达的作用。皮肤伤口愈合是一种动态的病理生理过程，由细胞外基质分子，生长因子/细胞因子与各种驻留细胞(包括角质形成细胞，成纤维细胞和浸润性白细胞)的复杂相互作用所安排。VEGF作为一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂源，进一步诱导新生血管形成，促进肉芽组织生成，从而加快创面愈合，实现促进小鼠深部组织压力性损伤血管新生的作用。研究表明，涉及表皮和真皮的伤口部位添加纯化的PDGF可导致新合成的结缔组织和表皮层的宽度显著增加，且具有剂量依赖性[15]。TGF-β参与伤口愈合的许多过程如炎症应当，刺激血管生成，成纤维细胞增殖，胶原蛋白合成以及新细胞外基质的沉积和重塑[16]。本实验检测时小鼠皮肤创伤处于快速恢复期，6-姜酚治疗能够显著提高PCNA、α-SMΑ表达，促进伤口愈合，本实验与在大鼠皮肤损伤研究中具有相似的治愈效果[17-18]。本实验中6-姜酚治疗组小鼠创面愈合率优于正常组，具有促进伤口愈合的功效。实验结果表明，6-姜酚治疗后伤口部位出现更多的毛细血管结构和血管壁增厚现象，且6-姜酚治疗组组中PDGF、 VEGF、 TGF-β1、PCNA、α-SMΑ的表达量显著升高(P<0.05)。

综上所述，6-姜酚对于促进组织创伤愈合效果显著，其可能机制与6-姜酚提高伤口组织中相关因子的表达相关。但6-姜酚是否通过直接靶向作用于生长因子，以及6-姜酚的治疗剂量在临床中是否具有同样治疗效果还有待后期进一步深入研究验证。