胶原自组装与化学交联制备水凝胶及其性能表征
2021-06-07田振华何静瑄
田振华, 何静瑄, 王 颖
(陕西科技大学 轻工科学与工程学院 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021)
0 引言
胶原是一种广泛分布于生物体内,具有特殊功能的蛋白质.因具有优异的生物学性能,胶原被广泛应用于生物医药、食品、化妆品等领域[1].在生理条件下,胶原分子能够自组装形成胶原纤维并包裹水溶液形成胶原水凝胶,进而构成宏观网络结构.与胶原分子相比,胶原纤维降解速率更慢,引起的炎症反应更轻,更易于与细胞结合,可作为一种重要的组织工程支架材料.因此,基于胶原自组装设计和合成形成具有纤维结构的生物功能材料已成为研究热题[2].
然而，自组装形成的胶原水凝胶力学性能和热稳定性较差,在生物医学材料领域的应用受到了一定限制[3].为提升胶原水凝胶的性能,人们通常对胶原水凝胶进行化学改性[4,5].羧甲基纤维素(CMC)是天然纤维经过化学改性后获得的一种水溶性好的聚阴离子化合物.它廉价易得,具有保水性、成膜成型性、分散稳定性的优点[6].CMC经氧化后所得到的氧化羧甲基纤维素(OCMC)具有高活性的醛基,可与胶原的氨基发生有效的共价结合[7](如图1所示).
Tan等[8]用双醛羧甲基纤维素作为交联剂通过冻融法制备海绵状胶原冻凝胶,改性后凝胶表现出较好的热稳定性,表明OCMC可作为良好的交联剂.然而,先前的研究多关注OCMC交联胶原分子,对于OCMC对胶原纤维所构建的胶原水凝胶性能的影响探究较少,因此本课题提出先借助自组装机理制备胶原水凝胶,再用OCMC进行化学改性,期望提高胶原水凝胶的性能.
(a)OCMC制备原理示意图
(b)OCMC与胶原的反应示意图图1 OCMC制备及其与胶原的反应示意图
1 实验部分
1.1 主要试剂和仪器
1.1.1 主要试剂
胶原海绵、氧化羧甲基纤维素钠,实验室自制;氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠,AR,广东光华科技股份有限公司;茚三酮,AR,国药集团化学试剂有限公司.
1.1.2 主要仪器
TU-1900紫外可见分光光度仪,北京谱析通用仪器有限责任公司;Vertex70傅里叶变换红外光谱仪,德国布鲁克公司;Agilent 5100原子力显微镜,美国Agilent公司;DSC 200P3差示扫描量热仪,德国Netzsch公司;DHR-1流变仪,美国TA公司.
1.2 胶原水凝胶的制备
将冻干的胶原海绵于冰水浴下用磷酸盐缓冲液(PBS,10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,100 mmol/L NaCl,pH～7.4)进行溶解,得到5 mg/mL的胶原溶液.于37 ℃下培养3 h制备胶原水凝胶,随后将水凝胶浸泡于含有不同量OCMC的PBS缓冲溶液中,室温下反应24 h,最终得到OCMC与胶原的质量比(OCMC∶Col(w/w))分别为0∶1、0.3∶1、1∶1、2.5∶1、5∶1和10∶1的改性胶原水凝胶,依次命名为Col(0)、Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)、Col(5)、Col(10).
1.3 胶原水凝胶的性能检测
1.3.1 交联度检测
采用茚三酮法测定改性前后胶原水凝胶中自由氨基数量以计算交联度[9].将1 g胶原水凝胶、2 mL PBS缓冲溶液以及1 mL茚三酮溶液(5 mg/mL)于试管中均匀混合.沸水中避光反应15 min,将产生的蓝紫色溶液立即冷却.用紫外分光光度计测定显色溶液在570 nm处的吸光度,参比为去离子水.所有样品均测试三次取平均值.改性水凝胶的交联度(Crosslinking Degree)可以通过公式(1)计算:
(1)
式(1)中:An—纯胶原水凝胶吸光度;Ac—改性胶原水凝胶吸光度.
1.3.2 红外光谱
将胶原水凝胶样品置于硅胶板上、于室温(25 ℃、RH 65%±5%)下风干成膜,用去离子水多次洗涤去除盐,再次风干[10].采用傅里叶变换红外光谱仪检测,分辨率为2 cm-1,波数范围4 000～400 cm-1.
1.3.3 原子力显微镜
将胶原水凝胶剪成小条,粘贴在新剥离的云母片上;将OCMC配制浓度为25μg/mL的待测液,取5μL待测液滴在新剥离的云母片上.样品于室温条件下干燥24 h后以1 Hz的扫描速率在轻敲模式下进行测试.每个样品至少观察3个不同的位置以确定所得到的形貌的一致性.
1.3.4 热稳定性检测
准确称取胶原水凝胶(～10 mg)密封于铝坩埚中,以PBS缓冲溶液作参比.在温度范围30℃ ～ 85 ℃,升温速率5 ℃/min,吹扫气20 mL/min条件下得到DSC曲线,曲线峰值即对应样品的热变性温度(Td).
1.3.5 动态频率扫描测试
将样品分别置于平板直径为40 mm,板间距为2.5 mm的流变仪中,选取2%的恒定应变[11],于30 ℃下进行动态频率扫描,频率范围为0.01～10 Hz,记录样品的储能模量、损耗模量以及损耗因子随频率变化的曲线图.
1.3.6 蠕变测试
将样品分别置于平板直径为40 mm,板间距为2.5 mm的流变仪中,温度设为30 ℃,施加8 Pa的恒定应力并持续100 s,记录样品的形变率.
2 结果与讨论
2.1 交联度
图2为不同量OCMC改性胶原水凝胶的的交联度曲线.随着OCMC用量的增加,胶原水凝胶的交联度呈上升的趋势.Col(0)、Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)、Col(5)、Col(10)的交联度分别为0、16.7%、21.3%、26.8%、43.9%和60.6%.
图2 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的交联度
当OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1时交联度上升较快,说明胶原纤维中与OCMC醛基进行交联的活性氨基较多.当OCMC∶Col(w/w)>0.3∶1后,交联度变化缓和,说明参与反应的活性氨基数量在逐渐减少.理论上,当OCMC分子的醛基与胶原纤维的活性氨基数量比值为1∶1时,胶原内的自由氨基基本完全反应,交联度达到100%[12].然而Col(10)的交联度仅为60.6%.推测原因是赖氨酸以及羟赖氨酸侧链上的一些活性氨基被包裹在纤维内部,而大分子OCMC由于空间位阻难以进入纤维内部与氨基反应.
2.2 红外光谱
图3为纯胶原水凝胶及改性胶原水凝胶的红外光谱及其局部放大图.从图中观察到，酰胺A带、B带出现在约3 327 cm-1处和3 082 cm-1处,归属于N-H的伸缩振动与氢键的耦合及C-H的伸缩振动;酰胺I带出现在1 663 cm-1处,归属于C=O基团的拉伸振动;酰胺II带出现在1 555 cm-1处,归属于酰胺基中N-H弯曲振动和C-N伸缩振动的耦合;酰胺III带出现在1 240 cm-1左右,归属于C-O的伸缩振动;1 450 cm-1归属于CH3不对称弯曲振动.理论上OCMC分子中的醛基与胶原中的自由氨基发生交联生成C=N基团,但在红外光谱上并未观察到C=N基团的吸收峰,主要的原因是其吸收峰位于1 650 cm-1附近,被强度较高的酰胺I带(1 663 cm-1)所掩盖[13].此外,分别出现在1 660 cm-1、1 555 cm-1附近的酰胺基中的C=O伸缩振动、N-H弯曲振动和C-N伸缩振动吸收峰来自螺旋结构[14],在一定程度上可说明胶原的三股螺旋结构存在与否.而且,胶原的酰胺A带、B带以及III带也与其三股螺旋结构密切相关[15].改性后胶原的这五个特征吸收峰均未发生明显移动,表明胶原的三股螺旋结构构象仍然保留[16,17].
(a)全波段红外光谱图(4 000～400 cm-1)
(b)红外光谱局部放大图(1 780～930 cm-1)图3 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的红外光谱
为了进一步证实胶原的三股螺旋是否保持完整,通过以下两种方法来判断:
(1)AⅢ/A1450表示酰胺III带与1 450 cm-1处特征峰的吸光度比值,若比值接近于1.00,表明胶原的三股螺旋结构完整;反之,若比值远小于1.0则说明胶原三股螺旋结构被破坏.例如明胶,虽与胶原的氨基酸组成一样,但不具有三股螺旋结构,其比值为0.59[18].
(2)Δv=v1-v2表示酰胺I与酰胺II之间波数的差值,若差值接近100 cm-1则判断胶原三股螺旋结构具有完整性[19].
表1为不同用量OCMC交联胶原的AⅢ/A1450与Δv值.两者均可以说明改性胶原仍具有完整的三股螺旋.
表1 不同用量OCMC交联胶原AⅢ/A1450、Δv值
2.3 微观形貌
图4为OCMC及不同用量OCMC交联胶原水凝胶的AFM图.纯胶原水凝胶表面以自组装形成的纤维结构为主[12],排列杂乱且多以单根纤维的形式存在.而改性胶原水凝胶的微观结构虽同样具有典型纤维结构,在纤维的分布排列上却有明显差异.
(a)Col(0) (b)Col(0.3)
(c)Col(1) (d)Col(2.5)
(e)Col(5) (f) Col(10)
(g)OCMC图4 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的AFM图(尺寸:2 μm × 2 μm)
Col(0.3)和Col(1)中胶原纤维开始两两结合形成“纤维单元(FU)”[12],表明交联反应首先发生在相邻胶原纤维之间.Col(2.5)中OCMC浓度的提高使得交联作用更加明显,FU间开始发生交联,多个FU聚集成团(A),且排列具有一定的方向性.Col(5)中相距较远的胶原纤维在不同方向上发生相互交联,出现聚集现象.这是由于胶原纤维之间的OCMC分子变多,彼此之间发生自聚,导致分子链变长,相距较远的胶原纤维得以在不同方向上发生交联.Col(10)中胶原纤维之间的排列已经非常紧密并趋于稳定.综上所述,OCMC的引入使得改性胶原水凝胶结构更加规整紧密.而OCMC本身粘连较为严重,基本观察不到纤维形态.证明改性胶原水凝胶的规整结构是由于交联作用而不是OCMC自身的形貌.
2.4 热稳定性
图5为不同用量OCMC交联胶原水凝胶的热变性温度曲线.图中Col(0)的Td值为47.0 ℃,改性水凝胶的最高Td值达到61.7 ℃,相较于Col(0)提高了14.7 ℃.
图5 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的热变性温度曲线
当OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1时,胶原纤维开始相互交联并定向排列,改性胶原水凝胶热变性温度从47.0 ℃提升至52.1 ℃,提升幅度较大.当0.3∶1
与纯胶原水凝胶相比,改性胶原水凝胶的热稳定性有所提高,完全破坏其三股螺旋结构需要的热量随之提高,大大扩宽了胶原水凝胶的应用范围[20].
2.5 动态频率扫描
图6为不同用量OCMC交联胶原水凝胶的储能模量G′、损耗模量G″及损耗因子tanδ值随频率变化的曲线.储能模量G′是胶原水凝胶发生弹性形变时储存的能量,它反应胶原水凝胶的弹性行为,与胶原水凝胶的交联程度有关.而损耗模量G″则是作为评价胶原水凝胶粘性特征的一个指标[21].从储能模量曲线来看,随着交联剂浓度的增加,胶原水凝胶的储能模量呈现递增的趋势,曲线的斜率却在减小,说明在同频率变化范围内,改性胶原水凝胶比纯胶原水凝胶对频率变化的敏感程度要弱,且弹性特征越来越明显,抵抗外力的能力增强.
(a)储能模量G′
(b)损耗模量G″
(c)损耗因子tanδ图6 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的动态扫描曲线
表2为1 Hz下不同用量OCMC交联胶原水凝胶的G′、G″和tanδ值.Col(0.3)的储能模量相较Col(0)提升了10.8 Pa,变化幅度较大,说明相邻胶原纤维间的交联大大增加了胶原水凝胶的储能模量.Col(1)的储能模量相较Col(0.3)仅提升2.6 Pa,变化幅度相对较小,而Col(5)储能模量较Col(1)增加了21.3 Pa,变化幅度有所提升.推测由于交联剂使纤维单元之间的交联进一步加强形成纤维单元,继而相距较远的胶原纤维之间也进行交联,胶原纤维出现聚集现象.由于胶原纤维之间的交联聚集排列基本趋于稳定,虽然交联剂用量翻倍增加,Col(10)的储能模量仅提升5 Pa,变化幅度不大.
表2 1 Hz时胶原水凝胶的G′、G″和tanδ值
在整个频率范围内,不同胶原水凝胶的G′值远远超过G″值,说明自组装时胶原纤维间的缠结作用赋予了纯胶原水凝胶明显的弹性特征.随着OCMC用量的增加,G″只是在小范围内波动.表明交联剂并未破坏纤维之间的物理缠结,胶原水凝胶弹性提升的同时,仍保留了部分柔性.不同改性程度的胶原水凝胶表现出相近的柔性,因此随着OCMC用量的增加,粘性模量基本相近.
损耗因子tanδ为损耗模量G″与储能模量G′的比值,当tanδ<1时,材料主要表现弹性特征,当tanδ>1时,材料表现的是粘性特征.如表2所示,在1 Hz时tanδ值均小于0.14,说明胶原水凝胶的弹性特征占主导.当OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1时,从tanδ曲线相对位置可以看出,这一过程对胶原水凝胶弹性的影响比较显著,tanδ值降低幅度较大.而当OCMC∶Col(w/w)≥1∶1后,OCMC用量增加,tanδ值仍在减小,变化幅度却较小,Col(10)与Col(0)相比,损耗因子从0.137降至0.094.
综上,不同用量OCMC对胶原水凝胶进行交联改性能能够进一步提高胶原水凝胶的弹性,使胶原水凝胶抵抗形变的能力得到提升.
2.6 蠕变分析
图7是不同用量OCMC交联胶原水凝胶的形变率(Deformation Rate)随时间的变化曲线.在施加应力后,不同交联剂用量的胶原水凝胶都发生了一定程度的形变,表明胶原水凝胶是一种弹性材料,具有蠕变性[10].其中Col(0)的形变率最大,达到了13.4%,Col(10)的形变率最低,只有7.9%.Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)和Col(5)的形变率介于两者之间,分别为13.1%、10.7%、8.7%、8.0%.
图7 不同用量OCMC交联胶原水凝胶的形变率
胶原水凝胶的形变率与其抵抗形变的能力直接相关,形变率越大,该胶原水凝胶抵抗形变的能力越弱[21].交联键的引入使得胶原纤维之间的交联作用加强,水凝胶抗形变的能力得到提高,不容易发生形变.Col(0.3)与Col(0)相比,由于交联剂浓度较低,胶原纤维虽交联形成了纤维单元,但水凝胶的形变率仅从13.4%降至13.1%.当0.3∶1
综上,加入OCMC进行交联后,胶原水凝胶的胶原纤维间交联程度逐步提高,最终聚集排列紧密,并趋于稳定,因此形变率逐渐降低,即抵抗形变的能力增强.
3 结论
借助胶原自组装机理制备水凝胶,经氧化羧甲基纤维素钠交联后得到改性胶原水凝胶.改性后的胶原仍保留完整的三股螺旋结构.随着交联剂用量的增加,水凝胶的性能先升高后趋于稳定.当OCMC∶Col(w/w)≤5∶1时,改性水凝胶性能提升最快.当OCMC∶Col(w/w)=5∶1时水凝胶的热变性温度、储能模量和形变率分别为59.1 ℃、136.0 Pa和8.0%.而后OCMC用量虽翻倍增加,但胶原纤维排列已非常紧密,水凝胶性能变化不大.
