人组织激肽释放酶11在甲状腺乳头状癌患者血清和组织中的表达及临床意义

吴 彤，兰正苍，刘志昌，杨 斌，段瑞雪，高笑欣，瞿洪洋，刘宏斌

0 引 言

甲状腺癌(thyroid cancer,TC)是源于甲状腺滤泡细胞或滤泡旁细胞的内分泌相关的恶性肿瘤[1]。近年来，作为TC最常见的类型，甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)的发病率迅速增加[2]。世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)发布的全球最新癌症负担数据显示：2020年甲状腺癌全球新增人数达59万，发病率占全球女性癌症新发例数第5位；中国新增人数达22万，发病率占中国女性癌症新发例数第4位[3]。临床上大多数PTC患者的长期预后总体较好；但一部分患者早期仍然发生肿瘤复发转移。目前, 临床上主要通过触诊、 超声、 核素显像及细针穿刺细胞活检等方法对甲状腺结节进行评估,使甲状腺癌诊断的准确性有所提高, 但仍有10%～30%无法明确诊断[4]。早期精确诊断TC方法的探索用以干预甲状腺肿瘤向恶性肿瘤的进展过程具有重要意义[5]。从基因层面揭示甲状腺癌的发病机制，在早期辨别出TC高低风险，在明确诊断后对患者进行个体化管理，避免过度医疗，形成标准化、合理化、个体化的治疗模式[6]。

组织激肽释放酶家族(humankallikrein，KLKs)是一类具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶，由15个成员(KLK11-KLK15)组成，具有丝氨酸蛋白酶活性的物质[7]。丝氨酸蛋白酶在刺激恶性肿瘤的细胞生长、血管生成和细胞外基质降解等过程中发挥重要的作用，肿瘤细胞的浸润和转移与某些丝氨酸蛋白酶的异常表达有关，并可作为其预后指标[8]。KLK3亦称为前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen， PSA)，临床上在前列腺癌的筛查中十分重要[9]。此外，KLK12据报道是乳腺癌的独立和有利的预后标志[10]。KLK11是该家族的成员之一, 研究表明KLK11在卵巢、前列腺、乳腺、肺、胰腺和结肠等癌组织中均有表达[11-13]。KLK11基因表达水平的诊断和预后潜力已有报道，如前列腺癌和卵巢癌等内分泌相关的癌症中[14]。目前，国内外关于KLK11在甲状腺乳头状癌上的研究报道甚少。本研究通过对PTC血清和组织中KLK11的检测，探讨KLK11在PTC的表达水平及其与肿瘤发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析我院普通外科行手术治疗，临床资料完整，术后经病理学检查证实为甲状腺乳头癌的90例患者资料。回顾90例甲状腺乳头癌患者术前1 d清晨空腹外周血以及40例健康对照者外周血，以及90例甲状腺乳头癌患者术后癌组织、匹配的癌旁正常组织。纳入标准：①术前患者行颈部彩超检查均发现有甲状腺结节并有手术指征；②术前未行放化疗及其他任何抗肿瘤治疗；③患者及家属知情并同意本研究者；④术后病理进一步证实为PTC患者。排除标准：①既往有肿瘤病史或同时并发其他恶性肿瘤；②合并自身免疫性疾病、其他恶性肿瘤应用放化疗史；③基础资料缺失，无法纳入统计分析。本研究经解放军联勤保障部队第九四〇医院医学伦理委员会审查通过(审批编号：2020KYLL146)。本实验在中国临床实验注册中心注册通过审核(ChiCTR2000040341)。

1.2实验试剂和方法

1.2.1 实验试剂研究所用试剂包括：人KLK11 ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)；兔抗人KLK11多克隆抗体[爱必信(上海)生物科技有限公司]；即用型免疫组化 SP 试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；PBS 缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司)；柠檬酸组织抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司)；DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2.2实验方法采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测PTC组和正常对照组血清中KLK11表达含量，绘制ROC曲线初步分析PTC患者血清中KLK11的诊断价值。

采用免疫组织化学法检测KLK11在PTC组织和匹配正常癌旁组织的表达水平，应用统计学方法进一步分析KLK11在PTC患者癌组织表达水平与临床病理参数关系。免疫组化结果判定：由2名病理科医师采取双盲法阅片。其中阳性染色可被染成淡黄色或棕褐色不等。采用双评半定量法进行评分，阳性染色肿瘤细胞的比例分级如下:0%为0分、1%～15%为1分、15%～45%为2分、>45%为3分；染色强度分级如下：0(无染色)、1(弱染色、淡黄色)、2(中等染色、黄褐色)、3(强染色、棕褐色)。染色指数计算如下:染色指数(SI) =染色强度×阳性染色肿瘤细胞比例，染色指数：0分为阴性，1～12分为阳性，<3分为低表达，≥3分为高表达。

2 结 果

2.1 KLK11在PTC患者和正常对照患者血清中的表达根据ELISA实验结果显示，PTC患者血清中KLK11含量(1 232.06±133.99)pg/mL，正常健康对照者血清中KLK11含量(1 029.45±137.29)pg/mL，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 ELISA法检测PTC患者和正常对照者血清中KLK11的表达含量

2.2KLK11在PTC患者血清中的检测意义以PTC患者为实验组和正常体检者为对照组，绘制ROC曲线初步分析血清KLK11在PTC患者的诊断价值。KLK11的ROC曲线下面积为0.854(95%CI：0.783～0.925，P<0.001)，诊断价值较好,见图2。由ROC曲线的结果得出KLK11对PTC诊断的临界值为1 073.37 pg/mL，此时KLK11在PTC检测中的敏感性87.78%、特异性70.00%。PTC组和正常对照组的阳性率分别为87.78%和30.00%。

图2 血清KLK11在PTC诊断的ROC曲线

2.3KLK11在PTC癌组织和配对正常癌旁组织表达水平根据免疫组化结果显示，KLK11蛋白主要在PTC的细胞质中表达，见图3。其阳性率为72.22%(65例)，高于配对的癌旁正常组织中的21.11%(19例)，差异有统计学意义(χ2=47.232，P<0.05)。其中，KLK11在有淋巴结转移、腺外侵犯以及Ⅲ-Ⅳ期的PTC癌组织中为高表达，在无淋巴结转移、腺外侵犯以及Ⅰ-Ⅱ期的PTC癌组织中为低表达，见图4。

2.4KLK11在PTC患者癌组织表达水平与临床病理参数关系PTC患者不同淋巴结转移、腺外侵犯以及TNM分期情况KLK11表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

a:PTC癌组织高表达; b:癌旁正常组织无表达

a:淋巴结转移癌组织高表达; b:淋巴结无转移癌组织低表达; c:腺外侵犯癌组织高表达; d:腺外无侵犯癌组织低表达; e:TNM Ⅲ～Ⅳ期癌组织高表达; f:TNMⅠ～Ⅱ期癌组织高表达

表1 KLK11在PTC患者癌组织表达水平与临床病理参数关系

3 讨 论

TC在全球范围是常见的恶性肿瘤。近几年，TC的发病率迅速增长，成为公共卫生的潜在威胁[15-16]。TC的发生发展主要受基因组变异的驱动，包括肿瘤启动子基因的激活和肿瘤抑制基因的沉默[17-19]。目前，细针穿刺细胞活检是甲状腺结节临床评估最准确和最具成本效益的工具，美国甲状腺协会强烈建议将其作为标准化临床操作[20-22]。然而，10%～30%病例的细胞学结果具有不确定性，并被标记为不确定的或可疑恶性肿瘤。在这些细胞学不确定的病例中，大多数患者接受了部分或完全甲状腺切除术；而术后病理报告结果显示只有6%～30%的细胞学不确定病例被确定为恶性，这使得临床手术效率极低且非特异性，增加了患者的治疗费用[23-24]。分子生物标志物可用于癌症的诊断、预后、肿瘤分期、监测对治疗干预的药物反应，以及确定肿瘤复发或缓解[25]。因此，寻找一种在临床上能够早期精确区分甲状腺结节良恶性的生物分子是十分必要的。使用肿瘤的分子特征来优化外科和医学治疗正在成为许多肿瘤学领域的标准，并且在甲状腺结节和甲状腺癌患者中具有巨大的潜力[26]。

KLKs(KLK1～KLK15)是一组分泌型丝氨酸蛋白酶，与多种癌症密切相关，与肿瘤的增殖、迁移和侵袭等方面有关[27-29]。所有的KLKs均具有丝氨酸蛋白裂解酶的活性，并以一种级联的方式相互激活，并激活其他的分子，并以这种方式参与肿瘤的发生[30]。KLKs在细胞发育和生理学中的生物学作用非常重要，因为它们参与血压调节、精血块液化、组织重塑、肽激素加工和炎症级联反应[31]。在癌症发生发展过程中，KLKs能够发挥促进肿瘤生长和抑制肿瘤生长的作用。在许多研究中，KLKs被证明具有肿瘤抑制剂的功能，KLK10在急性淋巴细胞白血病和乳腺癌中表现为下调[32-33]，而KLK3的下调可能与前列腺癌的侵袭性有关[34]。KLK6的上调在促进胃癌细胞的生长、迁移和侵袭中起重要作用[35]。另一方面，KLKs可能直接或间接通过细胞外基质成分的重塑和信号转导级联的激活来调节恶性细胞的血管生成、侵袭和转移，从而导致其恶性表型[36]。此外，KLKs可能通过与尿激酶型纤溶酶原激活剂、蛋白酶激活受体和基质金属蛋白酶等信号转导途径相互作用发挥作用，从而参与广泛的分子网络[37]。根据已完成最全面的表达谱，KLKs在人类多种组织和体液中存在，且具有不同程度的特异性[38]。KLK11是该家族的成员之一，位于染色体19q13.4上，是在人海马体中首次发现的，之后证实其在多种组织中表达[39]。KLK11由上皮细胞分泌，免疫定位于核上区室，代表细胞的高尔基体。KLK11已被证明在脑、皮肤、唾液腺、胃、前列腺和肠等人组织中均有表达[40]。KLK11在耐药细胞系中也高度表达，比如奥沙利铂耐药细胞。研究表明，敲除KLK11可通过阻断PI3K/碱性磷酸酶信号通路逆转奥沙利铂耐药性[41]。KLK11在原发性鼻咽癌组织表达水平高于慢性黏膜炎症的鼻炎组织，在复发的鼻炎癌组织表达水平也高于原发性组织[42]。

本研究通过ELISA法检测了PTC患者和健康对照者血清中KLK11的表达含量，发现PTC患者血清KLK11含量增高，并且其对PTC的诊断也有一定价值。这与Xu等[43]人的研究报道是一致的，该团队研究发现在138例非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清KLK11高于健康对照者，血清KLK11与NSCLC的TNM分期、淋巴结转移和远处转移等病理参数相关，使其成为肺癌诊断的潜在指标。本研究又通过免疫组织化学法分析PTC癌组织和匹配癌旁正常组织中KLK11的表达水平，并且了分析KLK11表达水平与PTC患者临床病理参数的相关性。研究发现，KLK11在PTC患者癌组织中阳性表达率增强，主要定位于细胞质中，且其表达水平与PTC患者淋巴结转移、腺外侵犯及TNM分期相关，进一步说明KLK11可能参与了PTC的发生、发展过程以及其恶性生物学行为。Diamandis等[44]研究发现血清KLK11在卵巢癌和前列腺癌患者中浓度升高,且在卵巢癌组织中KLK11定位主要出现在肿瘤细胞的细胞质中。目前，在临床上对PTC的诊断还没有一种灵敏度高、特异性强的生物分子标志物，本研究显示在PTC的血清和组织中，KLK11表达水平增强，这为以后PTC分子标志物寻找提供了参考，当然还需要进一步通过细胞实验等方法进行验证。

综上所述，KLK11在PTC患者血清和组织中表达增强，推测KLK11可能参与了PTC的发生、发展过程，其高表达与PTC的恶性生物学行为有关。本研究存在样本量小且来自单中心，样本数据不够大，采取的实验方法只能从蛋白水平反映KLK11在PTC的诊断价值，缺乏基因层面调控的证据，需要进一步更深层的研究。