皮质酮对原代培养海马神经元中IDO和5-HTT的调控作用*

谭 瑞，刘 任，彭晓凤

1.重庆市巴南区人民医院药剂科，重庆 401320；2.重庆医科大学药学院药理教研室/重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016；3.重庆市合川区人民医院药剂科，重庆 401520

抑郁症是一个严重的心理健康问题，也是一个世界性的公共卫生问题。抑郁症的发生与多种机制有关。下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能失调[1]、突触间隙5-羟色胺(5-HT)水平下降[2]、脑源性神经营养因子(BDNF)表达下调[3-5]均是抑郁症发病的重要机制。但目前对于HPA轴与5-HT和BDNF之间的关系在抑郁症发生、发展中的作用研究较少。脑内神经递质水平与其合成和转运密切相关。5-HT由色氨酸经色氨酸羟化酶(TPH)代谢合成。但是，色氨酸-TPH代谢途径合成5-HT减少时，其另一条代谢途径，即色氨酸-犬尿氨酸(KYN)合成代偿性增加，色氨酸-KYN途径的限速酶吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)被激活[6]。此外，5-HT的消除方式主要为5-HT转运体(5-HTT)的再摄取。5-HTT已经成为常用抗抑郁药的作用靶点。但IDO活性增加是否介导了HPA轴功能亢进引起的抑郁症，目前研究较少。本研究拟以皮质酮刺激原代海马神经元，模拟HPA轴亢进条件，并给予皮质酮受体拮抗剂米非司酮(Ru-486)处理，初步确定IDO、BDNF及5-HTT在HPA亢进所致抑郁症中的作用。

1 材料与方法

1.1试验动物 SPF级SD孕鼠，怀孕18 d，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2主要试剂 DMEM-F12、B27、胎牛血清均购自美国Gibco公司；5’-BrdU、多聚赖氨酸、胰蛋白酶、皮质酮、MTT检测试剂盒均为北京鼎国生物技术有限公司产品；Ru-486为武汉胜天宇生物科技有限公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏省碧云天生物技术研究所；Trizol、反转录试剂盒、SYBR Green Supermix和PCR引物购自Takara生物制剂公司；兔抗大鼠5-HTT、BDNF、IDO多克隆抗体购自博奥森生物科技公司；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体购自Santa Cruz公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo公司。其余试剂为国产分析纯试剂。

1.3方法

1.3.1原代海马神经元培养与鉴定 取怀孕18 d的SD大鼠，处死后迅速剪开腹腔取出胎鼠，分离海马组织，用0.125%的胰蛋白酶消化，800 r/min离心10 min，按2×106个/孔的密度接种，置于37 ℃、5% CO2孵箱培养。4 h 后神经元贴壁，更换培养液，以后每48 h半量更换培养液。于第7天经NeuN抗体(1∶100)的免疫细胞化学染色鉴定，纯度可达95 %以上，符合实验要求。

1.3.2MTT比色法检测不同浓度皮质酮作用不同时间对海马神经元细胞存活率的影响 神经元细胞按照密度为2×106个/孔接种于96孔板中，每孔的培养液为100 μL。于培养第7天加入不同浓度的皮质酮(1、5、10、50 μmol/L)分别作用2、 24、48 h后，每孔加入10 μL MTT，避光，37 ℃孵育4 h。吸出培养液，加入200 μL DMSO，摇床震荡10 min，至结晶物充分溶解，于酶标仪在490 nm波长检测吸光度值。每组设3个复孔，实验重复3次，通过吸光度值计算得到细胞存活率。

1.3.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测mRNA的表达 海马神经元培养第7天，加入皮质酮(5 μmol/L)，或同时加入Ru-486(1 μmol/L)，继续孵育24 h，按照RNAiso Plus Total RNA提取试剂说明书的操作程序提取总RNA。参照GenBank中大鼠基因序列，由重庆医科大学生物化学与分子药理学重点实验室设计引物，经Takara生物技术公司合成并验证,引物序列见表1。按照Takara Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA。反应条件为95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，对荧光强度达到阈值时的循环数(即Ct值)进行统计。根据相对定量公式进行计算，分析结果。每组重复3次。

表1 引物序列

1.3.4Western blot检测蛋白表达 海马神经元细胞经皮质酮或皮质酮+Ru-486共孵育24 h后，加入RIPA裂解缓冲液，冰浴条件下超声破碎细胞，12 000×g 4 ℃离心15 min，取上清液，用BCA法检测蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-聚丙烯胺凝胶电泳，然后进行转膜，封闭后加入一抗GAPDH(1∶1 000稀释)、IDO(1∶1 000稀释)、5-HTT(1∶1 000稀释)、BDNF(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000稀释)，再次洗膜后用ECL发光试剂显影，用Image Lab软件进行图像分析。以目标蛋白与β-actin条带的灰度比值表示蛋白表达的相对水平。每组重复3次。

2 结 果

2.1不同浓度皮质酮作用不同时间对海马神经元细胞增殖的影响 MTT比色法检测显示，不同浓度皮质酮处理海马神经元细胞2 h，细胞存活率无明显变化(P>0.05)；处理24 h和48 h，皮质酮均浓度依赖性地降低细胞存活率。皮质酮5 μmol/L处理海马神经元细胞24 h可明显降低细胞存活率(P<0.05)，故以5 μmol/L处理24 h进行后续实验。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.2皮质酮对海马神经元IDO、5-HTT和BDNF mRNA表达的影响 皮质酮5 μmol/L处理细胞24 h后，海马神经元IDO mRNA表达明显增加(P<0.05)，而BDNF mRNA表达明显减少(P<0.05)，但5-HTT mRNA的表达没有明显变化(P>0.05)。Ru-486 1 μmol/L可逆转皮质酮的作用，下调IDO mRNA表达(P<0.05)，上调BDNF mRNA的表达(P<0.05)。Ru-486处理对5-HTT的表达也没有明显影响(P>0.05)。见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05；与皮质酮处理组比较，#P<0.05。

2.3皮质酮对海马神经元IDO、5-HTT和BDNF蛋白表达的影响 与对mRNA表达的影响类似，皮质酮上调IDO蛋白表达(P<0.05)，下调BDNF蛋白表达(P<0.05)，但对5-HTT蛋白的表达没有明显影响(P>0.05)；给予Ru-486处理后，皮质酮对IDO和BDNF蛋白表达的作用明显被逆转(P<0.05)。Ru-486对5-HTT蛋白的表达也没有明显影响(P>0.05)。见图3。

注：与对照组比较，*P<0.05；与皮质酮处理组比较，#P<0.05。

3 讨 论

内分泌系统功能异常在抑郁症的发生中有重要作用[7-8]。HPA轴学说认为，当机体受到外界刺激时，下丘脑室旁核神经元分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，使垂体释放促肾上腺皮质激素(ACTH)，ACTH作用于肾上腺皮质，释放糖皮质激素(皮质酮/皮质酮)。而后，糖皮质激素作用于糖皮质激素受体，反馈性地调节CRH、ACTH的释放，阻断其兴奋效应[9]。而在抑郁发生时，由于持续的应激反应，机体产生过多糖皮质激素，与海马糖皮质激素受体结合，损伤海马结构和功能，对HPA轴的负反馈抑制作用减弱，机体生成更多糖皮质激素，HPA轴功能表现亢进[10]。海马是情绪调节和学习记忆的重要脑区，HPA轴亢进损伤海马神经元结构和功能，故抑郁患者出现情绪和认知障碍[11]。现常以皮质酮损伤海马神经元细胞模型研究HPA 轴亢进与抑郁的相关性[12]。本研究结果显示，皮质酮呈浓度依赖性和时间依赖性损伤神经元。皮质酮5 μmol/L作用24 h，海马神经元即出现明显损伤。

单胺学说是抑郁症发生的重要学说之一。临床目前使用的抗抑郁药大多以该学说为基础。目前研究发现，抑郁患者和动物模型体内普遍HPA轴亢进，血清皮质酮/皮质酮水平较正常组明显升高[13]，同时伴随5-HT水平下降[14]。但对于HPA轴亢进是否能引起5-HT减少，以及通过何种途径使5-HT作用下降，目前未见报道。本研究结果显示，给予皮质酮刺激后，海马神经元IDO mRNA和蛋白表达均下调，且糖皮质激素受体拮抗剂Ru-486可逆转皮质酮的作用，提示皮质酮作用于海马神经元糖皮质激素受体，激活IDO，使色氨酸-KYN途径增强，而色氨酸-TPH途径减弱，5-HT合成减少。但皮质酮对5-HTT的表达没有影响，提示HPA轴亢进并不是通过增强5-HTT的作用增加5-HT再摄取来减少5-HT水平。

已有研究证明BDNF下降与抑郁发生有明显相关性。抑郁症患者5-HT2受体超敏，激活“Gq蛋白-磷脂酶C(PLC)-三磷酸肌醇(IP3)-Ca2+通道”，抑制BDNF合成，损伤神经保护机制和突触可塑性，使抑郁患者工作记忆功能受损[15]。本研究显示，皮质酮作用可使海马神经元BDNF表达下调，该作用可被Ru-486逆转，提示HPA轴亢进，使5-HT合成减少后，可能通过下调BDNF表达，导致抑郁发生。

综上所述，本研究结果提示皮质酮可能通过激活海马神经元细胞内糖皮质激素受体，上调IDO表达，减少BDNF表达，诱导抑郁症发生；值得注意的是，皮质酮并未直接影响5-HTT的表达。