利拉鲁肽通过下调NF-κB及相关炎性因子减轻糖尿病大鼠脑缺血损伤的研究*

勿坡巫且,邓才洪,李伍基，杨 林，沈树安，白子格

1.四川省凉山彝族自治州第二人民医院神经内科,四川西昌 615000；2.成都大学附属医院神经内科,四川成都 610000

脑梗死属于缺血性脑血管疾病，是最常见的疾病之一，严重危害人类健康，其具有发病率高、致残率高、病死率高、复发率高等特点[1]。糖尿病和缺血性脑血管病常常伴发，脑梗死患者发病时合并糖尿病的约占20%[2]。糖尿病可增加脑梗死患者的病死率、致残率和复发率[3]，因此推测糖尿病可能会促进脑梗死的发展与恶化。利拉鲁肽是一种治疗糖尿病的药物，是人工合成的胰高血糖素样肽(GLP-1)类似物，其同源序列与天然的GLP-1高度吻合[4]，具备天然GLP-1的各种生理作用。近年的研究发现利拉鲁肽可顺利透过人体的血脑屏障[5]，与脑内GLP-1受体(GLP-1R)相结合从而发挥抗炎、抗氧化应激等作用。本研究通过建立大脑中动脉缺血(MCAO)糖尿病大鼠模型，探讨了利拉鲁肽在糖尿病脑缺血中的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 实验动物为54只SPF级雄性SD大鼠，每只280～320 g，8～10周龄，购买于佛山市医学实验动物中心。

1.2实验试剂 利拉鲁肽注射液购自丹麦诺和诺德生物科技有限公司)；链脲佐菌素(STZ)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Sigma公司；髓过氧化物酶(MPO)过氧化氢还原法检测试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；鼠源性抗体肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、兔源性抗体核转录因子-κB(NF-κB)购自美国Santa生物科技公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉生物科技有限责任公司。

1.3方法

1.3.1实验分组 将54只雄性SD大鼠按随机数字表法随机分成数量相等的3个组，分别为假手术组(S组)、糖尿病合并脑缺血组(Di组)、利拉鲁肽干预糖尿病合并脑缺血组(Li组)，每组18只。

1.3.2糖尿病大鼠模型的制作 参照制备糖尿病大鼠模型相关文献[6]：Di组和Li组大鼠高脂高糖饮食喂养14 d后，对其禁食禁饮8 h以上，左侧下腹部腔内注射STZ 20 mg/kg，24 h后再次同部位注射STZ 35 mg/kg。密切动态观察大鼠症状和体征变化，采用罗氏血糖仪测定尾尖静脉血糖，若随机血糖>16.9 mmol/L且伴有多饮、多尿、体质量下降等表现判定为糖尿病大鼠模型制作成功(7 d内判定)。S组大鼠腹腔注射等体积经灭菌处理的枸椽酸/枸椽酸钠缓冲液。Li组大鼠糖尿病模型制作成功后再给予利拉鲁肽注射液100 μg/kg(每12小时给药1次),连续注射7 d(包括MCAO手术日)。各组大鼠均连续监测血糖14 d。

1.3.3MCAO模型制作 糖尿病大鼠模型制作成功后，Di组和Li组(给予利拉鲁肽进行干预后)均采用Longa线栓法建立永久性MCAO模型。S组将线栓插入距颈内外动脉分叉10.0～12.0 mm处，其余各组将线栓插入至颈动脉分叉处(18.0±0.5)mm(略感阻力为止)。

1.3.4神经功能缺损评分及实验动物剔除 根据文献[5]进行评分：0分，无功能缺损体征；1分，不能伸展对侧前爪子；2分，向病灶对侧转圈圈；3分，轻推鼠背时向瘫痪处倾倒；4分，无自发活动和意识；5分，死亡。在模型制作后24 h进行神经功能缺损评分，1～4分视为制模成功，0分和5分者剔除。

1.3.5TTC染色检测脑梗死面积 MCAO模型建立48 h，随机取各组大鼠6只进行麻醉断头取脑(在冰上进行)，脑组织置于-20 ℃冰箱中速冻10 min，将大脑平均冠状切为5片，厚度约2 mm。置于2% TTC磷酸盐缓冲液(PBS)内，37 ℃锡箔纸避光孵育30 min，翻面染色，正常脑组织会被染成红色而梗死区不会被染色。4%多聚甲醛固定12 h，随后拍照，照片采用Image J软件进行分析，计算脑梗死面积百分比。

1.3.6脑组织MPO活性的检测 MCAO模型建立48 h后，每组中随机取6只大鼠，断头取脑，取缺血区脑组织(S组取手术侧)超声波粉碎(30 s，3次)，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，保持温度20～25 ℃，按试剂盒说明要求操作，取上清液于分光光度计下立即进行扫描，检测吸光度，随后按公式计算MPO的活性 。

1.3.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织中的IL-1β水平 MCAO术48 h麻醉断头取脑，取缺血区脑组织(S组取手术侧)，每组称取100 mg,加入9倍体积4 ℃ 0.9%生理盐水，用超声波粉碎机将标本制成组织匀浆，置入冷冻离心机，以4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上清液用于检测，按试剂盒的说明书进行操作，随后在不同波长的分光光度仪中测定吸光度值。

1.3.8脑组织NF-κB和TNF-α蛋白的Western blot检测 各组分别取6只大鼠脑缺血组织作为检测标本，将所取标本与SDS裂解液按一定比例混合在冰上快速研磨10 min，用脑组织匀浆器反复匀浆，置于4 ℃冷冻离心机高速离心，以12 000 r/min离心5 min，收集离心完成的上清液提取总蛋白(NF-κB进行核蛋白提取)，应用标准的BCA法进行总蛋白定量。取处理好的样品加入等体积2×电泳样品缓冲液均匀混合，以每条泳道上样20～25 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后将蛋白电转至硝酸纤维膜上，用5%全脱脂奶粉(溶解于2×PBS)封闭，常温下孵育1 h，加入与抗原相对应一抗[兔抗大鼠NF-κB(1∶600)或羊抗大鼠TNF-α(1∶500)]，在4 ℃摇床上缓慢摇振并孵育过夜；反复使用PBS-T(1 L PBS 中加入1 mL吐温-20溶液)洗膜5次,每次10～12 min，随即加入含HRP标记的二抗[山羊抗兔(1∶7 000)，兔抗山羊(1∶7 000)]，避光条件下常温孵育1 h；反复使用PBS-T洗膜5次,每次10～12 min，用ECL显色剂显色，拍摄滤膜相片，用HPIAS-1000病理图文分析系统进行胶带图像分析，获取各组胶带显影的平均吸光度，将目的蛋白与内参蛋白(β-Actin)吸光度比值作为目标蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1各组的血糖水平的变化 S组注射前与注射后(监测血糖第14天时)血糖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Di组、Li组注射后(监测血糖第14天时)血糖水平均比注射前显著升高(P<0.05)；Li组注射后(监测血糖第14天时)血糖水平低于Di组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠腹腔注射STZ或枸椽酸/枸椽酸钠缓冲液前后血糖水平变化

2.2神经功能缺损评分 Di组和Li组评分均高于S组(P<0.05)，Li组评分低于Di组(P<0.05)，见表2。

2.3脑梗死面积 TTC染色后S组无梗死区，其余组均有梗死区，见图1。与S组比较，Di组和Li组的梗死面积百分比显著增加(P<0.05)；与Di组比较，Li组的梗死面积减小(P<0.05)，见表2。

表2 各组神经功能缺损评分及梗死面积百分比比较

图1 术后各组48 h的TTC染色结果

2.4MPO活性的测定 Di组和Li组的脑组织MPO活性高于S组(P<0.05)；Li组MPO活性低于Di组(P<0.05)，见表3。

2.5ELISA检测脑组织IL-1β水平 Di组和Li组脑组织IL-1β水平高于S组(P<0.05)；Li组脑组织IL-1β水平低于Di组(P<0.05)，见表3。

2.6Western blot检测脑组织中的NF-κB和TNF-α蛋白表达水平 Di组和Li组的NF-κB、TNF-α蛋白相对表达水平高于S组(P<0.05)；与Di组比较，Li组的TNF-α、NF-κB蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 3组脑组织MPO活性、IL-1β水平及NF-κB、TNF-α相对表达水平比较

3 讨 论

本研究发现利拉鲁肽可减少糖尿病脑缺血组织的梗死面积百分比和改善神经功能缺损评分，显著降低缺血脑组织中MPO的活性和IL-1β水平，可显著下调NF-κB和TNF-α蛋白的表达水平。利拉鲁肽具有抗炎作用，利拉鲁肽下调上述炎性因子可能是保护糖尿病合并脑缺血患者神经细胞的机制之一。

糖尿病是严重威胁人类健康的慢性疾病，易并发各类严重的血管疾病。曾有研究报道糖尿病是脑梗死发病或(和)预后不良的独立危险因素之一[7]。本研究中，Di组大鼠神经功能缺损评分比Li组大鼠更高，梗死面积百分比更大，提示糖尿病是导致脑缺血病情加重的重要因素之一。

利拉鲁肽为GLP-1长效类似物，由基因重组技术合成，半衰期为13 h，用于2型糖尿病患者的治疗。有研究显示，利拉鲁肽可透过血脑屏障，与颅内GLP-1R结合而发挥作用[8]。国外学者研究发现利拉鲁肽有抗炎性反应的作用[9]。利拉鲁肽能够通过抗氧化和抗炎效应上调血管内皮生长因子(VEGF)，显著减轻大脑中动脉阻塞所致的脑缺血再灌注损伤[10]。利拉鲁肽可通过抗炎、抗凋亡和抗氧化应激等作用，减少糖尿病大鼠脑缺血引起的神经细胞损伤，是一个神经保护剂[11]。本研究表明，利拉鲁肽通过一系列抗炎性反应、抗氧化应激作用，可显著减轻糖尿病模型大鼠的脑缺血损伤程度。MPO为中性粒细胞活化的标记物，其活性是评价中性粒细胞在组织中浸润的关键指标[12]。本研究显示，Di组和Li组脑组织MPO活性均较S组显著升高，神经功能缺损评分和脑梗死面积百分比显著增大，表明中性粒细胞浸润与糖尿病合并脑缺血发生发展关系密切，而利拉鲁肽干预后MPO活性下降，神经功能缺损评分和脑梗死面积百分比均显著降低，表明利拉鲁肽具有降低MPO活性的作用，从而降低糖尿病合并脑缺血损伤的程度。

研究已证实NF-κB、TNF-α、IL-1β为促炎性细胞因子，在脑缺血发生、发展中发挥重要作用，参与脑缺血损伤加重的过程[13]。IL-1β在炎症启动阶段发挥关键作用。NF-κB是真核细胞中尤为重要的核转录因子，其参与了众多基因表达与调控。研究发现脑缺血后其表达显著上调，随后促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β也表达上调，从而加重炎性反应和脑缺血损伤，故通过抑制NF-κB蛋白表达可减轻脑缺血损伤。在本研究中，Di组NF-κB、TNF-α蛋白表达水平和IL-1β表达水平均较S组显著增高，提示其参与了糖尿病脑缺血损伤的病理过程，利拉鲁肽干预后NF-κBT、NF-α和IL-1β表达水平均显著下调，相应的神经功能缺损评分和脑梗死面积百分比也降低，表明利拉鲁肽减轻糖尿病脑缺血大鼠的神经损伤可能与其下调炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β相关。

本研究表明，利拉鲁肽对糖尿病脑缺血损伤者神经功能的保护作用可能主要是通过下调炎性因子的表达水平实现的。因利拉鲁肽广泛应用于临床治疗，是治疗糖尿病合并脑缺血的新途径，本研究为探讨利拉鲁肽保护糖尿病脑缺血损伤者神经细胞的作用机制明确了方向。