miR-21/PDCD4调控环路在子宫内膜异位症相关性 卵巢癌患者中的表达及意义

黄勇，范奇琪，傅君

(宁波市妇女儿童医院 妇产科，浙江 宁波 315012)

0 引言

探寻EAOC的发病机制，明确治疗靶向是提高EAOC质量效果的关键。微小RNA(miRNA)是一类长22nt的非编码RNA，通过靶向结合在目的基因的3’UTR区域，在转录后水平抑制其表达，进而调控下游一系列的基因表达，参与了机体内发育、增殖、分化和凋亡等众多生物学进程[1]。既往研究表明，作为致癌微小miRNA之一，微小核糖核酸21(miR-21)在胃癌、肺癌、肾癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达。程序性细胞死亡基因(pmgrammed ceu death 4，PDCD4)是miR-21具有重要生物学功能的靶基因之一，与癌细胞的凋亡、转移有关[2]。本研究探讨miR-21/PDCD4调控环路在EAOC患者中的表达，为EAOC的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2015年7月至2019年10月我院手术的EAOC患者共30例，年龄34～65岁，平均(52.1±13.3)岁，均为首次手术，未行放疗、化疗、激素、生物免疫治疗。所有患者标本均经病理学确诊并按照WHO标准及国际妇产科联盟标准(FIGO，2009年)进行组织学分级和手术-病理分期：低分化9例，中分化11例，高分化10例；Ⅰ-Ⅱ期14例，Ⅲ-Ⅳ期16例。对照采用同期30例因子宫肌瘤行子宫切除术患者的正常卵巢组织。年龄33～67岁，平均年龄(51.1±12.7)岁。

1.2 实验试剂

Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO 康 为 世 纪)；miRNA Purification Kit 提取试剂盒(CW0627S，CWBIO 康为世纪)。PDCD4引物及探针通用生物系统(安徽)有限公司合成。

1.3 实验设备

-80℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)；移液枪(eppendorf)；低温高速离心机(5424R，Eppendorf)；旋涡混合器(XH-C，常州越新仪器制造有限公司)；紫外分光光度仪(NP80，NanoPhotometer)；干式电加热器(GL-150，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.4 收集组织样本

30例EAOC组织样本由宁波宁波市妇女儿童医院提供。同时选取同期30例因子宫肌瘤行子宫切除术患者的正常卵巢组织，病理分析为正常卵巢组织。所有标本均置于液氮内保存。

图3 miR-21mRNA溶解曲线图

1.5 提取总RNA

将冻存于-80的gEAOC组织拿出，取50-100mg于液氮低温条件下研磨，加入至盛有1mL Trizol的1.5mL EP管中。超声破碎，充分溶解，震荡30s，室温放置 5min 12000×g 低温离心10min，弃沉淀。加0.2mL氯仿，上下摇动30s，室温孵育5-10min。12000×g，4℃离心，15min。吸上层无色水相，移入另一EP管中。加等体积异丙醇沉淀RNA，颠倒混匀2～3次后室温放置10min。12000×g，4℃离心，10min。弃上清，加冰预冷75%乙醇1mL，温和振荡，悬浮沉淀。7500×g，4℃离心，5min。弃上清，重复洗涤后，室温干燥5-10min。溶沉淀于20μlDEPC水中，测定浓度与纯度。

1.6 进行逆转录反应

(1)将离心管插入干式电加热器中，先在25℃条件下保持5min，然后转到50℃条件下保持15min，最后在85℃条件下保持5min(如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃，有助于提高产量)。(2)产物可立即用于QPCR反应，或在20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。实验获得采用比较CT值法(2-△△Ct 法)。分别计算EAOC组织与正常卵巢组织的△Ct值计算公式：改变的倍数=2-△△Ct；△Ct试验=Ct目的-Ct内参；△Ct对照=Ct目的-Ct内参。

1.7 引物合成公司

通用生物系统(安徽)有限公司，见表1。

表1 miR-21-5p/U6引物序列

1.8 统计学方法

采用 SPSS 19.0进行检验，计量数据用均数±标准差表示，两均数的比较用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EAOC组织与正常卵巢组织miR-21/PDCD4表达水平比较

RT-PCR检测结果显示，EAOC组织中miR-21表达水平明显高于正常卵巢组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，与正常卵巢组织比较，EAOC组织中PDCD4表达水平明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 EAOC组织与正常卵巢组织miR-21/PDCD4表达水平比较

2.2 PCR结果图片

扩增曲线显示对数期阶段模版拷贝数与荧光累计值之间存在线性关系。溶解曲线辨明miR-21均为单峰，扩增产物单一，引物具有特异性和可信性。见图2-3。

图2 miR-21mRNA扩增曲线图

2.3 EAOC组织中miR-21/PDCD4 表达与临床病理特征的关系

EAOC组织中miR-21mRNA、PDCD4 mRNA表达与患者年龄、是否绝经、病理类型无关(P>0.05)。miR-21mRNA表达与EAOC组织患者FIGO分期、是否转移有关(P<0.05)。PDCD4 mRNA表达与EAOC组织患者FIGO分期、分化程度否转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 EAOC组织中miR-21/PDCD4 表达与临床病理特征的关系

3 讨论

miR-21是microRNA家族中的一个亚型，其具有自主转录单位的miR-NA，参与肿瘤的发生、发展。有研究发现，在多种癌组织活检样本中miR-21过度表达[3-4]，且预示乳腺癌、结肠癌患者的进展与预后[5-6]。miR-21可能作为肿瘤诊断、预后的重要标志物。qRT-PCR检测结果显示，EAOC组织中miR-21表达水平明显高于正常卵巢组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，miR-21随着肿瘤分期的增高呈上调趋势。扩增曲线显示对数期阶段模版拷贝数与荧光累计值之间存在线性关系。溶解曲线辨明miR-21均为单峰，扩增产物单一，引物具有特异性和可信性。

PDCD4 是一种新的抑癌基因，在多种恶性肿瘤组织中PDCD4 呈下降或缺失表达。Ma等[7]研究发现，在消化道肿瘤中低分化的PDCD4表达水平明显低于高分化组。还有研究发现，PDCD4的表达下降或缺失与肿瘤的不良预后相关[8]。本研究结果发现，PDCD4在EAOC组织和正常卵巢组织中表存在显著差异。本研究还显示PDCD4 mRNA与EAOCFIGO分期、分化程度、转移有关。FIGO分期越高PDCD4的表达越低；分化程度越低PDCD4的表达越低；有淋巴结转移的PDCD4表达低于无淋巴结转移。表明PDCD4的表达减少或缺失与EAOC的分期分化、转移有明显的关系[9-11]。

本研究EAOC组织中miR-21表达水平明显高正常卵巢组织，PDCD4表达水平明显下调，与EAOC的发生、转移密切相关，miR-21mRNA与PDCD4 mRNA是EAOC发生、发展中的一对具有重要意义的癌基因和抑癌基因，有助于EAOC的诊断及分期。