基于网络药理学探讨清胰汤治疗急性胰腺炎的作用机制

王夏雨，施继禹，贾傲，杨振伟，崔云峰

（1.天津医科大学研究生院，天津 300070；2.天津市南开医院肝胆胰外科，天津 300100）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是临床中较为常见的外科急腹症之一，具有发病急、进展快的特点，经常出现局部和全身并发症，病情较重者可发生全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至出现器官功能的衰竭[1]。目前尚没有针对AP发病的特效药物，治疗多以对症支持治疗为主[2]。中药因其多靶点的药理活性特征，在治疗AP的实践中相较于西药具有更佳的疗效和预后价值[3]。清胰汤（QingyiTang，QYT）及其加减方作为全国广泛运用的AP治疗方剂，在临床实践过程中疗效显著[4]。现已有研究显示QYT可通过抗凋亡、减少坏死、减轻炎症反应等途径起到治疗AP的作用[5]，但其具体治疗靶点、作用机制仍待探索。本文以网络药理学为基础，探讨QYT治疗AP的潜在分子机制，并对通过筛选得到的重要生物学进程进行实验验证，以期为QYT治疗AP的分子机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 建立QYT化合物数据库 通过BATMANTCM中药系统药理数据库，依次检索QYT全方中药（柴胡、黄芩、延胡索、黄连、木香、白芍、大黄、芒硝）化学成分。根据BATMAN-TCM数据库中药物动力学参数，得到活性成分作为候选化合物及靶点。去重后得到与有效成分关联的靶点1 853种，构建QYT化合物数据库。

1.2 AP预测靶点的筛选 通过Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)以“acute pancreatitis”为关键词检索，筛选收集AP相关靶点，并将疾病数据库靶点信息进行整理。

1.3 QYT对AP的共同靶点获取 将QYT药物靶点与疾病靶点于Venny在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)录入取交叉，得到药物与疾病发生作用的共同靶点。

1.4 “中药-活性成分-靶点”网络模型构建 将QYT全部中药活性成分靶点和AP疾病靶点蛋白导入至Cytoscape3.7.1软件，生成“中药-活性成分-靶点”的网络图。

1.5 药物-疾病靶点蛋白相互作用网络构建 将筛选得到的“QYT-AP”活性化合物成分共同靶蛋白录入STRING 11.0[6]（https://string-db.org/）数据库，分析得到蛋白-蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）网络。

1.6 功能富集分析 将QYT治疗AP的作用靶点，以Gene Symbol的格式导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本位论功能（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。设定阈值P＜0.05，筛选具有显著性差异的生物学过程和通路。

1.7 动物实验

1.7.1 药物和仪器 雨蛙肽及脂多糖购自Sigma；中药QYT[柴胡5 g，黄芩3 g，胡黄连3 g，白芍5 g，木香3 g，延胡索3 g，生大黄（后下）5 g，芒硝3 g]购自天津市南开医院药房，采取水煎法制备药物：药液比例为1:1的QYT浓缩液；α-淀粉酶（AMS）试剂盒（淀粉-碘比色法）购自南京建成生物工程研究所；LC3、P62、β-actin抗体均购自Abcam公司。石蜡组织块包埋机、病理切片机、摊片机、烘片机、病理染色机、全自动玻璃盖片机、显微镜均为美国Leica公司。

1.7.2 实验动物准备及分组24只体重为20～22 g雄性健康C57 BL/6小鼠（SPF级），购自北京华阜康生物科技股份有限公司[小鼠许可证号：SCXK（京）2014-0004]，饲养于天津市南开医院试验动物中心。适应性喂养1周后，将小鼠随机分为正常对照组8只，AP模型组（AP组）8只，QYT+AP模型组（QYT组）8只。全部小鼠在自由饮水条件下禁食12 h后开始实验。依据文献[7]，采取雨蛙肽及脂多糖腹腔注射方法制备小鼠AP模型。对AP组、QYT组小鼠腹腔注射雨蛙肽（50 μg/kg），每小时1次，连续注射7次；在第7次注射的同时给予脂多糖（10 mg/kg）腹腔注射。QYT组在第1次雨蛙肽注射前1 h及第7次雨蛙素注射后1 h，予以QYT（10 mL/kg）灌胃。正常对照组小鼠予以同等次数、剂量的生理盐水腹腔注射及灌胃。

1.7.3 标本采集与检测 末次注药后12 h处死小鼠，收集小鼠血清样本。使用血清淀粉酶试剂盒检测血清淀粉酶含量，严格按照说明书操作进行；切取胰腺组织标本，一部分进行固定、包埋、切片、HE染色，封片后于光学显微镜下观察各组胰腺组织结构并依照Schmidt病理评分标准[8]对其严重程度进行评分。

1.7.4 胰腺组织自噬情况检测 取小鼠胰腺组织1 mm3于4℃条件下用2.5%戊二醛固定2 h，经锇酸固定、乙醇脱水、丙酮浸润、3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色后切片等步骤，于透射电镜下观察胰腺组织并拍照。

1.7.5 自噬相关蛋白表达检测 另取部分小鼠胰腺组织，于含PMSF的RIPA裂解液中充分匀浆裂解，进行BCA蛋白定量检测蛋白浓度后，采用Western印迹法检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表达情况，经SDS-PAGE电泳、PVDF转膜、封闭、发光成像等步骤，用Image J软件分析灰度值以获知蛋白表达水平。

1.8 统计学处理 所有数据采用Graph Pad Prism8.0.2软件进行处理，计量资料用±s表示，通过单因素方差分析比较各组间差异，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 QYT化学成分数据库及化学成分作用靶点数据库的筛选 通过BATMAN-TCM数据库检索清胰汤全方8味中药，以Inference Score＞20为筛选条件，柴胡共找到81种化合物，大黄58种，白芍35种，木香66种，黄芩63种，胡黄连23种，延胡索46种，芒硝（Na2SO4·10H2O)化合物信息未得到。删除重复值后，得到QYT中含有的214个化合物，并收集活性化合物的对应蛋白靶点，删除重复值后总共获取1 853个蛋白靶点。

2.2 AP疾病靶点数据库 通过在Gene Cards、CTD数据库中检索AP，选取Inference Score＞20分的蛋白靶点，筛选得到疾病相关靶点为1 000个。

2.3 QYT-AP共同靶点的筛选 在Venny 2.1在线软件作图工具平台上输入1 853个药物靶点、1 000个疾病靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点145个，见图1。

图1 QYT与AP靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of the target intersection of QYT and AP

2.4 QYT中药物活性化学成分和靶点QYT中有214个化合物，其中作用于145个药物-疾病共同靶点的化合物有121个，前30个化合物见表1。

表1 QYT化合物表Tab 1 Basic information of compounds from QYT

2.5 QYT干预AP的PPI网络图 将145个QYT干预AP的靶点导入STRING数据库，设置可信度（interaction score）为0.7，得到PPI网络图，见图2。根据拓扑指标度值（degree）调节节点颜色深浅以突出核心靶点，Degree结果显示白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、肿瘤抑制蛋白53（tumor suppressor 53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）等为QYT干预AP的核心靶点。

图2 QYT治疗AP的PPI网络Fig 2 PPI network of QYT in treating AP

2.6 GO生物学功能分析 通过DAVID数据库对145个共同靶点进行GO功能分析，根据FDR＜0.05进行筛选，共得到富集信息1 310条，其中生物学过程（biological process，BP）1 190条，分子功能（molecular function,MF）62条，细胞组成（cellular compo nent，CC）58条；BP、MF和CC前10条富集信息见图3。MF分析可看出靶点主要涉及载体活性，染色质DNA结合，羰基还原酶等分子功能。CC分析得出靶点主要涉及线粒体、线粒体基质、细胞质等细胞成分。BP分析得出靶点主要涉及核因子（NF）-κB正向调节、炎症反应、MAPK激活、JAK-STAT级联反应等生物学过程。

图3 QYT干预AP靶点GO功能富集Fig 3 GO function enrichment of QYT in treating AP

2.7 KEGG通路富集分析KEGG分析得到67条通路信息，依P值排序居前10位的结果见表2。

表2 KEGG富集分析潜在相关通路（前10位）Tab 2 KEGG pathway enrichment analysis for candidate related pathway targets(top10)

2.8 动物实验部分

2.8.1 各组小鼠血清淀粉酶结果 与正常对照组相比，AP组小鼠血清淀粉酶显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），QYT组血清淀粉酶明显低于AP组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各组小鼠血清淀粉酶含量比较（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

表3 各组小鼠血清淀粉酶含量比较（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

注：AP组：急性胰腺炎模型组；QYT组：QYT给药+AP模型组；AMY：血清淀粉酶；与正常对照组比较，*P<0.05；与AP组比较，△P<0.05

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2.8.2 胰腺组织病理变化HE结果可见正常对照组胰腺结构基本完整，组织被膜完整，细胞结构正常，排列紧密，无水肿和炎症浸润；AP组胰腺腺泡水肿，小叶结构破坏，间隔增宽，胰腺组织不同程度水肿坏死，伴大量炎性细胞浸润，胰腺导管内可见出血；QYT组也可见胰腺组织损伤，但程度明显较AP组降低，见图4。

图4 各组小鼠胰腺组织HE染色（100×）Fig 4 HE staining of pancreatic tissues of all groups(100×)

2.8.3 胰腺组织病理评分 与正常对照组相比，AP组胰腺组织病理评分均明显升高，具有统计学意义，与AP组相比，QYT组各项病理评分均明显降低，具有统计学意义（表4）。

表4 各组小鼠胰腺病理评分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

表4 各组小鼠胰腺病理评分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

注：AP组：急性胰腺炎模型组；QYT组：清胰汤给药+急性胰腺炎模型组；与正常对照组相比，*P<0.05;与AP组比较，△P<0.05

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2.8.4 小鼠胰腺组织电镜结果 如图5所示，电镜下观察到正常对照组的腺泡细胞结构规则，基底区粗面内质网丰富；AP组中，细胞结构破坏，胞质内自噬空泡明显增多，酶原颗粒增加，个别可见细胞核固缩，线粒体肿胀、嵴消失；QYT组的胰腺腺泡细胞超微结构病理改变程度明显轻于AP组，细胞结构较为完整，酶原颗粒较正常对照组增多。

图5 各组小鼠胰腺组织超微结构电镜图（25 000×）Fig 5 Electron microscopy images of pancreatic tissues in all groups(25 000×)

2.8.5 蛋白印迹实验 与正常对照组相比，AP组小鼠胰腺组织的LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表达水平均明显升高（均P<0.001）；与AP组相比，QYT组中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表达水平降低（均P<0.001），见图6。

图6 各组胰腺组织中自噬标志蛋白表达Fig 6 Expression of autophagy marker protein in pancreatic tissues in all groups

3 讨论

自噬作为分解代谢的过程，是维持细胞稳态的重要方式之一，在胰腺炎中，自噬被激活但溶酶体降解这一过程被抑制，自噬体形成增加与溶酶体降解降低之间的不平衡导致自噬通量阻滞，会导致严重的腺泡细胞变性和胰蛋白酶原激活，导致AP的发生[9]。现有研究证明，QYT可通过抗凋亡，减少坏死，减轻炎症反应等多途径发挥治疗AP的作用，其中包括通过改善肠屏障通透性缓解AP的炎症反应[10]，减少肠道内毒素的产生和吸收，缓解AP引起的肠道屏障损伤[11]，及通过减少Ⅱ型肺泡上皮细胞的凋亡来减少重症AP诱导的急性肺损伤等[12]。但对QYT治疗AP作用机制的研究相对孤立，基于分子机制的研究较少，故本研究通过网络药理学的技术方法，对于QYT治疗AP的作用机制进行分析，结果发现自噬是QYT干预AP的途径之一。

通路富集分析结果显示，QYT治疗AP的信号通路共67条，其中涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、炎症性肠病（IBD）、细胞凋亡、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Janus激酶/STAT、P53、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、MAPK等通路。其中PI3K/Akt/mTOR信号转导途径被认为是自噬启动和调节的主要途径[13]。PI3K通过磷酸化Akt，影响下游从而调节自噬。有研究表明mTOR激活后发生自噬，溶酶体重整可关闭自噬小体的形成，导致溶酶体重新形成，进入下一轮自噬[14]。AMPK通过磷酸化mTORC1等自噬相关蛋白来直接促进自噬，或通过调节转录因子下游的自噬相关基因的表达来间接促进自噬，硫化氢通过AMPK/mTOR途径过度激活自噬而加重AP[15]；自噬与p53之间存在重要关系，p53激活自噬，自噬也可以通过为DNA复制和修复提供底物来抑制p53激活[16]。在QYT与AP靶点作用的活性化学成分中，大黄中的大黄素（emodin），可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬[17]。大黄中的大黄酸（rhein）通过产生ROS经Fas死亡途径和线粒体途径诱导caspase依赖性凋亡，减弱自噬[18]。STRING结果显示，药物-疾病靶点主要作用于TP53、STAT3、IL-6、AKT1等靶点，IL-6通过多种互补机制调控自噬，包括抑制mTORC1的靶标和激活Akt，刺激LC3的转化和自噬体的形成，增加自噬酶产生。有研究表明miR-148a通过下调IL-6/STAT3信号转导抑制自噬而作用于AP[19]。STAT3可作为由IL-6激活的急性期基因转录增强子，通过上调自噬的负调节剂或下调必需的自噬基因，导致自噬抑制[20]。

动物实验结果证实，在雨蛙素联合脂多糖诱导的AP小鼠模型中，经QYT治疗后AP小鼠的炎症减轻，自噬反应减弱。

综上所述，QYT可能通过调节自噬发挥治疗AP的作用。但QYT干预自噬过程的具体通路仍不明确，需进一步完善体内外实验，进行通路和具体作用靶点的验证，为临床的合理应用以及新治疗方法提供思路依据。