LncRNA PTCSC3过表达诱导非小细胞肺癌A549凋亡和氧化损伤并抑制细胞增殖和迁移

陈鸿运，李晓明，黄国胜，杨金华，乔飞

（南阳医学高等专科学校第一附属医院普胸外科，南阳 473000）

近年来环境恶化、吸烟人数急剧上升导致肺癌患者逐年增加，目前非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLS）已经成为我国最常见的肺癌之一[1]。肺癌的治疗方式主要包括手术治疗和药物化疗[2]。随着科技的发展，使用长链非编码RNA（long noncodingRNA，lnc RNA）基因治疗成为目前研究的热点，目前lncRNA在众多疾病中均发挥着重要的作用[3]。XIA等[4]研究表明，lncRNAPTCSC3可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。WANG等[5]研究表明，lncRNAPTCSC3可以抑制乳腺癌细胞增殖。因此笔者推测lncRNAPTCSC3对肺癌A549细胞也有一定的抑制效果，但目前关于lncRNAPTCSC3对肺癌细胞的抑制研究较少，作用机制也尚不确定。因此本文旨在探究lncRNAPTCSC3对A549细胞的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料A549细胞由中国科学院细胞库提供；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；caspase-3抗体（货号：ab32351）、caspase-9抗体（货号：ab32539）、Ki67抗体（货号：ab92742）、p21抗体（货号：ab109520）、E-cadherin抗体（货号：ab1416）、N-cadherin抗体（货号：ab76011）购自艾博抗有限公司；凋亡检测试剂盒（货号：P-CA-201）购自武汉普罗塞生命科技有限公司；流式细胞仪购自BD公司；Transwell小室购自美国Corning Coseter公司；流式细胞仪（型号：CyoFLE）购自贝克曼有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代 快速取出A549细胞解冻，以1 000 r/min离心5 min，将培养箱温度设置为37℃，CO2浓度调节为5%，将细胞放入FBS、青霉素和链霉素混合的RPMI1640培养基中，待细胞融合到90%左右时，加入1 mL的胰蛋白酶消化传代培养，进行后续实验。

1.2.2 pcDNA-lncRNAPTCSC3重组质粒构建 根据引物设计软件设计lncRNAPTCSC3引物，使用PCR扩增产物，待pcDNA3.1-lncRNAPTCSC3的载体建立成功后，使用内切酶对PTCSC3基因进行双酶切处理，切后的产物应用琼脂糖凝胶电泳进行目的基因鉴定并将目的基因克隆到pc-DNA3.1质粒载体上，取出冷藏的感受态细胞，将感受态细胞和链接产物细胞于EP管中置于37℃培养箱中培养16 h，使用内切酶酶进行质粒重组，并对基因进行序列对比和鉴定。

1.2.3 细胞的分组和转染 将细胞分为对照组、pcDNA组和pcDNA-lncRNAPTCSC3组；其中pcDNA-lncRNAPTCSC3组将lncRNAPTCSC3导入到pc-DNA3.1载体中，再根据试剂盒说明书将质粒转染构建过表达的细胞株；pcDNA组加入转染试剂和vector瞬时转染A549细胞；对照组仅加入转染试剂。

1.2.4 RT-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测相关基因表达量 取各组A549细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后，反转录合成cDNA后PCR扩增，逆转录条件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min；检测各RNA表达水平，采用2-ΔΔCt法计算RNA的相对表达量，本实验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）为内参。基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences of genes

1.2.5 流式细胞仪检测 收集完成离心后的A549细胞，加入100 μL Binding Buffer重悬细胞，完成后分别加入5 μL Annexin V-FITC和PI，轻轻混匀，避光下孵育15 min，完成孵育后加入400 μL Binding Buffer上机检测。

1.2.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平 收集完成离心后的A549细胞，加入裂解液裂解后加入Loading Buffer缓冲液。测定蛋白浓度，将蛋白转移到PVDF膜上，保持在37℃的条件下，将脱脂奶粉调整浓度至5%并加入其中封闭2 h，完成封闭后加入caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的抗体（稀释比例1∶500），常规孵育。使用TBS洗净后上机检测，内参蛋白选定ACTIN（稀释比例1∶1 000），根据目的蛋白和内参蛋白的灰度值相比确定为目的蛋白的相对表达水平。

1.2.7 试剂盒检测活性氧簇含量 收集完成离心后的A549细胞，使用无血清的DMEM培养液培养A549细胞，加入10 μm/L的DCF-DA，置于37℃恒温箱中孵育20 min，洗涤后在光学显微镜下观察；同时收获细胞，每孔加入100 μL细胞悬液，将A549细胞浓度调至2×106/mL，使用荧光酶标仪测525 nm处的OD值。

1.2.8 细胞增殖能力检测 将细胞制成密度为1×103个/mL的单细胞悬液后，每孔加入0.4 mL的细胞悬液，放入细胞培养箱中培养2周，使用结晶紫染色，观察细胞生长情况并计算细胞克隆形成率。克隆形成率（%）=（克隆数/所种细胞数）×100%。

1.2.9 细胞侵袭能力检测 将细胞制成密度为1×105个/mL的单细胞悬液，将细胞加入Transwell小室上层中，在小室下层加入正常RPMI 1640培养液，调整培养温度为37℃，培养24 h后擦去小室内细胞，使用结晶紫对侵袭至小室下层的细胞进行染色，在光学显微镜下随机选择5个视野对细胞进行观察，统计侵袭细胞数目，本研究每组实验均重复3次。

1.3 统计学处理 数据分析采用软件SPSS 22.0，作图采用软件Graph Pad Prism 5，正态分布的数据采用±s表示，两组间比较采用t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 各组lncPTCSC3的表达水平检测结果 与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组PTCSC3基因表达水平显著升高（t=14.758，P<0.05），但pcDNA组PTCSC3基因表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 各组lnc PTCSC3的表达水平检测结果Fig 1 Expression of lnc PTCSC3 in each group

2.2 各组A549细胞凋亡情况及相关蛋白检测结果与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞凋亡率显著升高（t=12.188，P＜0.05），但pcDNA组A549细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相对表达水平显著升高（t=9.905、7.320，均P＜0.05），但pcDNA组cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相对表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 各组A549细胞凋亡情况及相关蛋白检测结果Fig 2 Apoptosis of A549 cells and related proteins in each group

2.3 各组A549细胞活性氧簇的含量检测结果与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞活性氧簇水平显著降低（t=10.276，P＜0.05），但pcDNA组A549细胞活性氧簇水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 各组A549细胞活性氧簇含量检测结果Fig 3 Contents of reactive oxygen species in A549 cells of each group

2.4各组A549细胞增殖情况及mRNA表达水平 与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞克隆形成率显著降低（t=9.615，P＜0.05），但pcDNA组A549细胞克隆形成率差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞中Ki67 mRNA表达水平显著降低（t=20.444，P＜0.05），p21 mRNA表达水平显著升高（t=13.975，P＜0.05），但pcDNA组A549细胞中Ki67 mRNA和p21 mRNA表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见图4。

图4 各组A549细胞增殖情况及mRNA表达水平Fig 4 Proliferation of A549 cells and related proteins in each group

2.5 各组A549细胞侵袭情况及相关蛋白检测结果 与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞单位面积侵袭细胞数目显著降低（t=6.576，P＜0.05），但pcDNA组A549细胞单位面积侵袭细胞数目差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高（t=7.443，P＜0.05），N-cadherin蛋白相对表达水平显著降低（t=14.992，P＜0.05），但pcDNA组E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白相对表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见图5。

图5 各组A549细胞侵袭情况及相关蛋白检测结果Fig 5 Invasion of A549 cells and related proteins in each group

3 讨论

LncRNAPTCSC3与多种肿瘤关系密切，本研究采用pcDNA-lncRNAPTCSC3将PTCSC3基因导入肺癌A549细胞中，与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组PTCSC3基因表达水平显著升高，说明细胞转染成功，为后续实验奠定了基础。氧化应激损伤是一种常见的细胞损伤，当细胞出现氧化应激损伤后会产生大量的活性氧簇，损伤细胞膜[6]。本研究检测各组细胞的氧化物质水平发现，与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞活性氧簇含量显著降低，证明表达PTCSC3基因对A549细胞氧化活性具有一定的调节作用。

细胞凋亡是指由基因调控的细胞自主性的程序性死亡，细胞主要通过细胞的凋亡调控内环境。目前研究较多的细胞凋亡相关蛋白家族主要包括caspase家族和Bcl-2家族。Caspase家族中caspase-3是常见的启动者，caspase-9是常见的执行者[7]。当细胞接收到凋亡信号后，会激活caspase-3并将凋亡信号传递至caspase-9，使得caspase-9活化，促进细胞的凋亡[8-9]。本研究中，与对照组相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞凋亡率显著升高，cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相对表达水平显著升高。说明过表达PTCSC3基因可以激活caspase家族中的凋亡起始子caspase-3，并通过其激活凋亡执行子caspase-9，使得细胞进入凋亡状态。王俭等[10]研究表明，通过A549细胞中细胞凋亡蛋白caspase-3的表达，从而促进细胞凋亡。

肿瘤的恶性生物学特征主要包括失控性增生、浸润和转移[11]。Ki67是一种与细胞增殖关系密切的增殖蛋白，其高表达表明细胞增殖加速，处于快速增殖阶段[12-13]。P21是Clp家族中的一员，p21与克隆及其在细胞周期控制与肿瘤发生中有重要作用，同时也与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关[14]。本研究结果显示，相比对照组，pcDNA-lncRNAPTCSC3组A549细胞克隆形成率、Ki67 m RNA表达显著降低，p21mRNA表达水平显著升高。说明当细胞过表达PTCSC3基因后，A549细胞中增殖相关基因Ki67受到了抑制，同时抑制了调控细胞周期的p21基因表达升高，表明肿瘤细胞的细胞周期受到了抑制，导致肿瘤细胞合成相关蛋白受阻，抑制了肿瘤细胞的增殖过程。金文静等[15]研究表明，调节肺癌A549中的长链非编码RNA的表达可以调控肿瘤组织中Ki67的表达，实现影响肿瘤细胞的增殖。

肿瘤的浸润和转移是其重要的恶性生物学特征之一，其中上皮间充质转化（epithelial mesenchyml transition，EMT）是影响肿瘤细胞极性的重要过程，可以影响肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[16]。EMT过程受到相关蛋白的调控，N-cadherin是N-钙黏蛋白，可以增强细胞的黏附能力，其高表达会使细胞的黏附能力增强，运动能力减弱[17]。E-cadherin也是调节EMT过程的重要蛋白，当E-cadherin减少会使间质细胞标志物如波形蛋白、纤连蛋白表达上调，诱导EMT的细胞因子、转录因子及辅助作用的一些酶表达上调。同时还会使得上皮细胞失去黏附连接的作用，导致组织结构松散，呈现梭形纤维细胞样形态，此时细胞会获得较强的侵袭及转移能力[18]。本研究发现，过表达PTCSC3基因可以通过减少E-cadherin蛋白，导致组织结构松散，使得上皮细胞失去了黏附连接的作用，增强细胞EMT，减弱细胞与细胞之间的黏附性，使得A549细胞的侵袭和迁移能力增强。

综上所述，过表达lncRNAPTCSC3通过调节氧化应激和相关蛋白表达水平，抑制NSCLS A549的增殖和迁移并促进其凋亡。