基于网络药理学酸枣仁生物碱抗抑郁作用机制的研究

孙丹晨，王志慧，乔卫

（天津医科大学药学院天然药物学系，天津 300070）

抑郁症是一种以情绪低落、自我价值感降低、快感缺失为主要症状的精神类疾病[1]，多伴有失眠症状，严重时有自残或自杀倾向，已成为严重威胁人类身心健康的世界性疾病。目前对抑郁症的治疗主要以西药为主，但是西药存在不良反应多、耐药性及过敏性等问题，所以对相关中药的研究日益迫切。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，是临床治疗失眠症、抑郁症、焦虑症的常用中药[2]，含有皂苷、黄酮、脂肪酸、生物碱等化学成分[3]。有研究表明，酸枣仁生物碱具有抗焦虑、镇静催眠、抗抑郁的作用[4]。酸枣仁生物碱所含化学成分类型多样，且通过多目标、多渠道、多层次综合调控发挥药效[5]。因此复杂的靶点和机制是研究的难点。目前网络药理学已广泛应用于中医药的研究和开发领域，为研究中医药与靶点疾病的关系提供了新的契机[6]。故本文应用网络药理学方法筛选酸枣仁生物碱治疗抑郁症的有效成分，并且对成分发挥作用的潜在靶点与信号通路进行整合与分析，初步阐明其抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；TCMDatabase@Taiwan（http://tcm.cmu.edu.tw/）；Pubmed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Pharm Mapper Server（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）；UniProtDatabase（http：//www.uniprot.org/）；Drug Bank Database（http：//www.drugbank.ca/，Version 4.3）；DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；美国化学文摘数据库（Chemical Abstract Service，CAS）；Chem Bio Draw Ultra 12.0；Cytoscape3.4.0。

1.2 酸枣仁生物碱主要成分收集 通过检索TCMSP、TCMDatabase@Taiwan、Pubmed、CAS等数据库收集酸枣仁生物碱成分。

1.3 主要成分抗抑郁潜在作用靶点的反向预测及筛选 根据已知18个酸枣仁生物碱成分的化学结构信息，利用Chem Bio Draw Ultra 12.0软件画出化学结构，并以（*sdf）格式保存，将文件上传Pharm Mapper Server，靶点蛋白种类选择为Human Protein Targets，每个中药成分将得到300个潜在抗抑郁的作用靶点[7]。然后在UniProt数据库中筛选作用靶点物种为人，并将名称校正为官方名称[8]，可以获得该靶点的基因、功效等相关信息。在Drug Bank数据库中检索目标靶点，并与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子抗抑郁药靶点对比。应用Cytoscape3.4.0筛选各靶点的Degree大于8的靶蛋白，用于生物网络图的构建。

1.4 抗抑郁靶点KEGG及GO分析 将Pharm Map－per Server中返回的与抑郁相关的潜在靶点上传到DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）数据库，进行GO分析和KEGG通路分析。KEGG整合了基因组、化学和系统功能信息，靶点蛋白直接反映到靶点通路上，药物靶向富集途径一般被认为是药物调节的途径和药物发挥疗效的机制。通过GO富集分析，获得靶标的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）富集项，并预测靶标的功能分布。

1.5 生物网络图的构建Cytoscape3.4.0是一款开放源码的图形化显示网络并进行分析和编辑的生物咨询软件，可将基因表达信息、靶点通路疾病相关功能注释整合进网络中，观察彼此之间的关联性[9]。每个节点（Node）分别代表成分、靶点、通路，节点与节点之间的连接即为边（Edge）代表各节点之间的相互作用。通过综合衡量3个指标即网络节点度（Degree）、中介中心性（Node betweenness）、接近中心性（Closeness）去评估网络图中每个节点的显著性。网络节点度、中介中心性、接近中心性值越大，揭示其在网络中的显著性越高。

2 结果

2.1 酸枣仁生物碱主要成分 通过检索化学专业数据收集并筛选酸枣仁生物碱成分，最终获得18个成分。具体化学信息如表1所示。

表1 酸枣仁生物碱成分的化学信息Tab 1 Chemical information of alkaloid constituents of ZSS

续表

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2.2 主要成分抗抑郁潜在作用靶点 将Pharm Mapper Server返回的作用靶点与Drug Bank中FDA批准的小分子抗抑郁药物靶点比对分析，筛选出15个抗抑郁相关潜在靶点（见表2）以及10个相关具有抗抑郁作用的活性生物碱成分（N-甲基巴婆碱、酸李碱、木兰花碱、荷叶碱、异紫堇定碱、原荷叶碱、乌药碱、观音莲明碱、鹅掌楸叶碱、酸枣仁环肽）。

表2 酸枣仁生物碱成分抗抑郁潜在靶点信息Tab 2 Information on potential antidepressant targets of alkaloid constituents in ZSS

2.3 潜在抗抑郁靶点KEGG通路 酸枣仁生物碱成分治疗抑郁症的15个潜在靶点共涉及131条相关信号通路。表3及图1列举出频率较高的8条相关信号通路。其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、钙离子信号通路是最主要的靶点通路。

表3 酸枣仁生物碱抗抑郁潜在靶点KEGG通路注释分析结果Tab 3 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

图1 酸枣仁生物碱抗抑郁潜在靶点KEGG通路注释分析结果Fig 1 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.4 GO富集分析结果 对酸枣仁生物碱的15个潜在抗抑郁靶点进行GO富集分析。分析结果可以用来研究靶标的功能分布，靶标的功能分布分别由3部分组成：生物过程、分子功能和细胞成分，如图2所示。分析气泡图可知，15个潜在抑郁靶点涉及17种生物进程，6个细胞组分以及13种分子功能（q<0.01，q<0.05，q<0.05）。RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、GTPase活性的正调控、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是潜在靶点参与的主要生物过程。在分子功能分析中，蛋白连接和Ras鸟苷-核苷酸交换因子活性是非常重要的；等离子体膜与细胞核是潜在靶点涉及的主要细胞成分。

图2 酸枣仁生物碱抗抑郁潜在靶点GO通路注释分析结果Fig 2 GO annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.5 生物网络图的构建与分析 如图3所示，酸枣仁生物碱抗抑郁失眠的“成分-靶点-信号通路”生物网络图由156个节点（10个成分、15个靶点及131条信号通路）和259条边构成。不同颜色的节点分别代表酸枣仁生物碱中抗抑郁失眠的活性成分、潜在靶点及调控通路，边代表三者之间的相互作用。节点的大小代表每个节点的网络节点度（Degree），度中心性越高节点就越大，越能显示出该节点在网络图中的重要性。分析网络图可知，酸枣仁生物碱成分荷叶碱、原荷叶碱、右旋衡州乌药碱、木兰花碱在“成分-靶点-信号通路”网络图中网络节点度较高，可能是治疗抑郁症的重要成分；预测获得的15个作用靶点中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶点基因可能是酸枣仁生物碱治疗抑郁症的主要靶点；PI3K-Akt信号通路、钙离子信号通路等可能是酸枣仁生物碱治疗抑郁症涉及的主要通路。

图3 酸枣仁生物碱抗抑郁“成分-靶点-通路”生物网络图Fig 3 Antidepressant'component-target-pathway'biological network diagram of alkaloids in ZSS

3 讨论

本文通过网络药理学方法，以抑郁症为目的疾病，筛选酸枣仁生物碱中具有抗抑郁的活性成分、作用靶点及相关通路。通过分析生物网络图发现，酸枣仁生物碱中有10个成分可能具有抗抑郁效果，其中荷叶碱、原荷叶碱、右旋衡州乌药碱、木兰花碱等成分对应的相关靶点个数较多，说明这些成分可能是酸枣仁生物碱发挥作用的重要成分，为确认酸枣仁生物碱抗抑郁有效成分提供了理论依据。

预测获得的15个作用靶点中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶点基因可能是酸枣仁生物碱治疗抑郁症的主要靶点。P0DP23是一种钙调蛋白（CALM1）。钙离子能在细胞内传递神经信号，广泛参与机体各种生理功能的调节[10]。P00533称为表皮生长因子受体（EGFR），是一种多功能跨膜糖蛋白，其配体可介导酪氨酸激酶活性。少量表皮生长因子（EGF）可使细胞分裂生长，与中枢神经系统损伤和修复密切相关。有研究表明，正常生理功能哺乳动物中枢神经系统（CNS）中EGF和EGFR的表达很低，但在CNS损伤后第7天，EGF和EGFR的表达显著增加，28 d后逐渐下降到正常水平[11]。据报道，磷酸化的EGFR和MAPK信号通路与小胶质细胞的活化具有协同作用[12]。P49841称为糖原合酶激酶-3β（GSK3B），是磷酸化后完全失活的激酶之一[13]。近年来越来越多的研究表明，GSK3B在抑郁症的发病和治疗中发挥着越来越重要的作用。例如：与正常人相比，在重度抑郁症死亡患者大脑皮质中GSK3B的活性显著升高[14]；持续刺激GSK3B（KI小鼠），氟西汀的促神经元再生及抗抑郁作用都会被消除[15]；选择性抑制GSK3B可导致动物产生抗抑郁作用等。P19793称为视黄酸受体（RXR-α），视黄酸通过视黄酸受体影响下丘脑促皮质激素释放因子（CRF）神经元的活性、控制CRF的表达，导致下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的功能异常，进而推测视黄酸信号系统对下丘脑CRF神经元的调节可能是抑郁症发病的一种新机制。研究发现，在给予成年大鼠少量的RXR-α选择性拮抗剂，可以缩短其在强迫游泳行为学检测中的不动时间，提示视黄酸可能通过RXR-α干预海马神经元活性和脑内单胺类神经递质等，从而控制下丘脑CRF的表达和HPA轴活性，进而参与抑郁发病过程[16]。

研究表明，PI3K-Akt信号通路参与了微血管损伤和血管生成，在抑郁症的发生中扮演重要角色[17]。有研究显示氟西汀可以使海马的Akt1表达增加，促进Akt磷酸化，从而加速血管的生成，促进海马血液循环，都有助于抑郁症的治疗[18]。钙离子信号通路与抑郁症关系密切，是治疗抑郁的重要机制之一。其作为一种钙受体蛋白，广泛存在于脑组织神经元中，在神经元的应激和修复过程中起关键作用。氟西汀和SNRIS可以激活大鼠前额叶皮质中的钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ（CaMKⅣ）。而CaMKⅣ抑制剂可在体外阻断cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化[19]。

本研究最终预测获得酸枣仁生物碱抗抑郁的生物网络图，从整体角度分析酸枣仁总生物碱的抗抑郁成分、主要靶点和通路。综上所述，酸枣仁生物碱中抗抑郁成分荷叶碱、原荷叶碱、右旋衡州乌药碱、木兰花碱主要通过影响神经信号传递、中枢神经系统损伤修复、HPA轴活性、PI3K-Akt通路活化以及MAPK反应级联等发挥抗抑郁作用，本研究为下一步抗抑郁活性成分分离及活性评价实验奠定了理论基础。