基于网络药理学探讨三七抗急性肺损伤相关分子机制

查玉杰，曹丽睿，何庆，2

（1.西南交通大学医学院，成都 610031；2.西南交通大学附属医院呼吸与危重症医学科，成都 610031）

急性肺损伤是由各种肺内外致病因素导致的急性、弥漫性炎症肺损伤，进而引起急性呼吸衰竭的临床综合征，以肺血管通透性增高、肺泡腔渗出富含蛋白质的液体、肺水肿以及透明膜的形成为主要病理特征。急性肺损伤是常见的呼吸危重症之一，在重症监护病房病死率高达40%～50%[1-2]。目前，急性肺损伤的治疗尚无特效药，常规治疗方法和药物主要包括原发病治疗、机械通气疗法、舒血管药（一氧化氮、前列腺素）、表面活性剂、抗氧化剂、糖皮质激素和抗炎药等[3]，但不能达到理想的治疗效果，病死率依然很高。近年来，人们对中医药治疗急性肺损伤进行了深入研究，显示出中医药治疗急性肺损伤的巨大优势[4]。

三七是五加科人参属植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，其主要化学成分为皂苷类，化学结构复杂，同时含有黄酮类、甾醇类、糖、挥发油、聚炔醇类、氨基酸和有机酸等化学成分，药用价值极高[5]。三七的药理作用主要体现活血止血，熟三七还具有补血益气以及抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节等作用[6]。有研究表明，三七总皂苷可以降低血浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量，缓解中性粒细胞浸润和肺水肿程度，清除体内氧自由基，有效地保护急性肺损伤[7]。

网络药理学是一门运用网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学分支学科[8]。中药具有多成分、多作用靶点和多作用途径的特点，而网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合，其作为一门新兴学科为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[9]。本研究采用网络药理学方法，从三七的物质基础出发，着眼于整体角度分析三七抗急性肺损伤的分子机制，同时为后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 三七活性成分与相关靶点筛选 在TCMSP数据库[10]以“三七”为关键词进行检索，获取三七的活性成分，再以药物动力学参数（药物口服生物利用度OB≥30%，药物相似性DL≥0.18）为筛选条件，以筛选后的结果作为三七的主要活性成分。再根据已发表的文献[11]补充三七总皂苷成分。在Pub Chem数据库中检索筛选出的各个成分的2D结构，保存其sdf格式文件，然后将每个sdf格式文件分别上传至Swiss Target Prediction数据库[12]，获得每个活性成分的预测靶点，并以Probability＞0作为纳入标准。最后统一在Uni Prot蛋白质资源数据库将各成分作用的蛋白质靶点进行规范。

1.2 急性肺损伤相关靶点筛选 在Gene Cards数据库以“Acute Lung Injury”为关键词进行检索，挖掘急性肺损伤相关的潜在靶点。在此数据库中Score值越高则代表该靶点与疾病联系密切，因此本次筛选设定大于20分的目标靶点作为急性肺损伤的潜在靶点。同样的，再分别在OMIM数据库和DisGe NET数据库中进行检索，获取与急性肺损伤相关的靶点。最后，对3个数据库获得的靶点进行合并，删除重复值后得到急性肺损伤的相关靶点。

1.3 三七成分-急性肺损伤靶点PPI网络构建 为明确三七与急性肺损伤之间的相互作用关系，通过Venny2.1.0绘制韦恩图，获得三七活性成分和急性肺损伤预测基因靶点的交集。将交集基因上传至STRING数据库[13]，限定物种为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设为大于highest confidence（0.900），隐藏游离的节点，获得交集基因的蛋白质相互作用（PPI）网络，并保存tsv格式文件。将结果导入Cytoscape3.7.2，得到PPI网络后再利用MCODE插件对PPI网络进一步分析。

1.4 三七成分-急性肺损伤靶点功能与通路富集分析Metascape平台[14-15]拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料。将交集基因导入该平台，物种和物种分析均选择“H.sapiens（68）”，设置P＜0.01，分4次分别对其主要生物学过程和代谢通路进行富集分析，保存结果并采用图像处理与分析在线平台对结果进行可视化。另外，再针对P值从小到大进行排序，筛选出P值最小的前20条KEGG通路，并绘制气泡图。

1.5 三七成分-急性肺损伤靶点-通路网络构建 根据筛选出的20条通路，利用Cytoscape3.7.2构建三七成分-急性肺损伤-通路网络，并采用其内置工具Network Analyzer分析网络图的网络拓扑参数，根据参数判断三七抗急性肺损伤的主要活性成分和关键靶点。

2 结果

2.1 三七活性成分与相关靶点 在TCMSP数据库进行初步筛选后共得到119种成分，以OB≥30%且DL≥0.18筛选后获得8种活性成分，分别为十八碳二烯（mandenol）、食脂素（DFV）、邻苯二甲酸二异辛酯（diop）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、人参皂苷Rh2（ginsenoside rh2）、人参皂苷f2（ginsenoside f2）、槲皮素（quercetin）。经文献查阅得到三七总皂苷的5种成分，分别为人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人参皂苷rd_qt（ginsenoside rd_qt）、三七皂苷1（notoginsenosider1）、人参皂苷Rb1（ginsenosiderb1）、人参皂苷Re（ginsenosideRe）。由于人参皂苷rd_qt、三七皂苷1、人参皂苷rb1在Pub Chem数据库未检索到2D结构的sdf文件，因此将这3个成分排除，而在后面的交集基因中未出现邻苯二甲酸二异辛酯的任何预测基因靶点，因此也将其排除。最终一共获得9种主要活性成分（见表1）。这9种活性成分从Swiss Target Prediction数据库获取预测基因靶点删除重复值后共有260个。

表1 三七主要成分及靶点数目Tab 1 The main components of Panax notoginseng and the number of targets

2.2急性肺损伤相关靶点 从Gene Cards数据库共获得6 400个靶点，由于得到的靶点数目较多，因此以条件Score值大于20分筛选后获得607个靶点；从OMIM数据库共获得275个靶点；从Dis Ge NET数据库一共获得93个靶点；合并3个数据库靶点再删除重复值后，最终得到917个基因靶点。

2.3 三七成分-急性肺损伤靶点PPI网络 利用Venny2.1.0绘制三七活性成分基因靶点与疾病基因靶点交集的韦恩图（见图1），从图中可以看到二者共有交集靶点68个（见表2）。将这68个基因上传至STRING数据库后得到其相互作用关系，将结果导入Cytoscape3.7.2后得到PPI网络图（见图2），网络图一共包含57个节点，168条边，图中节点颜色和大小代表每个靶点的Degree值，颜色越深，节点越大代表其Degree值越大，意味着这个靶点可能与三七抗急性肺损伤作用的关系越密切。通过比较，笔者推测Degree值最大的前5个靶点，即PIK3CA、PIK3R1、SRC、STAT3和VEGFA可能与三七抗急性肺损伤作用具有较大的相关性。

图2 三七成分-急性肺损伤靶点PPI网络Fig 2 PPI network of Panax notoginseng component-acute lung injury targets

表2 三七成分-急性肺损伤靶点Tab 2 Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

图1 三七成分-急性肺损伤靶点Fig 1 Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

此外，利用Cytoscape的插件MCODE对PPI网络进行了进一步分析，得到了两个PPI网络的潜在子网络（见图3），Cluster1包括12个节点、32条边，Cluster2包括8个节点、15条边。这两个子网络中的20个基因（MET、PIK3R1、F2、PIK3CA、ESR1、VEGFA、MMP9、APP、NR3C1、KIT、AGTR1、SRC、KDR、AKT1、HSP90AA1、PTK2、EGFR、STAT3、FGF2、IL2）可能是三七抗急性肺损伤作用的关键靶点。

图3 PPI网络中的子网络Fig 3 Sub-network in PPI network

2.4 靶点功能与通路富集分析结果 可视化基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析将基因的功能分为3个部分，分别是生物过程（biological process，BP）（图4A）、细胞组分（cellular component，CC）（图4B）以及分子功能（molecular function，MF）（图4C）。经过Metascape平台分析后，选取了具有代表性的富集表达集群（每个集群选一个）的前20或16的功能绘制了条形图。从图4A中可以看到，三七抗急性肺损伤参与的生物过程主要有氧化应激反应（response to oxidative stress）、炎症反应的调节（regulation of inflammatory response）、活性氧簇代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、对有毒物质的反应（response to toxic substance）、细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）以及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路（transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway）等。通过KEGG分析（图4D），可以看到三七抗急性肺损伤可能参与的通路有肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、核因子（NF）-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等。

图4 三七成分-急性肺损伤靶点富集分析Fig 4 Enrichment analysis of Panax notoginseng component-acute lung injury targets

另外，还选出了P值最小的前20条KEGG通路（表3），并绘制了气泡图（图5），可以看到富集基因较多的通路有磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K-Akt）信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信号通路（ras signaling pathway）、Rap1信号通路（rap1 signalin g pathway）以及血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）等。

图5 KEGG气泡图Fig 5 KEGG bubble diagram

表3 三七成分-急性肺损伤靶点通路富集结果Tab 3 Pathway enrichment results of Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

2.5 三七成分-急性肺损伤靶点-通路网络 根据上述20条通路绘制出了三七成分-急性肺损伤-通路网络（图6），图中节点颜色的深浅，形状的大小都代表其Degree值的大小。再运用Cytoscape3.7.2的工具Network Analyzer分析网络拓扑参数，其中以槲皮素的Degree值最大为38，Betweenness Centrality为0.37，Closeness Centrality为0.52，因此预测槲皮素为三七抗急性肺损伤的主要活性成分，其次为食脂素、十八碳二烯、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg1。其中基因Degree值排名最高的前5个基因分别为PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR，因此预测PIK3CA是三七抗急性肺损伤的主要靶点，其余如IGF1R、FGF2、MET、STAT3、KDR等亦是相对比较重要的靶点。

图6 三七成分-急性肺损伤-通路网络Fig 6 Panax Notoginseng components-acute lung injury-pathway network

3 讨论

在中医学中未出现过“急性肺损伤”的病名，但在中医古籍中对其临床症状却有论述，在《素问·咳论篇》中：“肺咳之状，咳而喘息有音，甚则唾血”就是对其临床症状的描述。根据其临床症状，咳嗽、呼吸困难、喘息鼻张等，可归为“喘脱”“结胸”“暴喘”等范畴[16]。中医药的治疗策略有祛邪扶正、清热解毒、活血化瘀、通里攻下、宣肺利水。多种中药具有抗炎、抗氧化作用，因此中药制剂和提取物对急性肺损伤的治疗亦是一大突破点[3]，如姜黄素、丁香提取物丁香酚等都具有一定的抗炎抗氧化作用，都有对急性肺损伤实验对象的肺功能的改善作用。

近年来，三七活性成分如槲皮素、三七总皂苷等对急性肺损伤的治疗研究有很多，表明三七对急性肺损伤有一定的改善作用。本研究通过网络药理学的方法初步筛选出了三七抗急性肺损伤的活性成分有槲皮素、食脂素、十八碳二烯、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg1等。研究表明，经槲皮素预处理后，可以通过抑制Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路的激活而改善气体交换功能，抑制炎性介质的释放，从而减轻内毒素诱导的急性肺损伤症状[17]。还有研究显示，槲皮素处理可以明显减轻海水吸入诱导的急性肺损伤小鼠的肺间质及肺泡腔出血、水肿，以及肺脏组织结构改变，减轻海水吸入诱发的M1型巨噬细胞极化，下调M1型巨噬细胞介导的促炎性免疫并上调抑炎性因子的表达，提示槲皮素可通过抑制肺M1型巨噬细胞极化及其介导的促炎免疫，减轻海水吸入诱导的急性肺损伤[18]。HSICH等[19]研究发现，人参皂苷Rh2可以通过调节小鼠的Toll样受体4（TLR4）/PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Raf-1/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。人参皂苷Rg1单用和联用抗生素亚胺培南均能够抑制脓毒症小鼠的急性肺损伤[20]，而且之前的一项研究表明，人参皂苷Rg1还可以通过改善炎症反应，调节M2型巨噬细胞的浸润和抑制肺细胞凋亡而对脂多糖诱导的急性肺损伤起到保护作用[21]。

本研究发现，三七抗急性肺损伤作用涉及的靶点主要集中在PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR等，涉及的主要通路有PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路等。PI3K-Akt信号通路是由酶联受体介导的能够调节细胞生命活动的信号通路，该通路参与多种生长因子、细胞因子、细胞外基质等的信号转导，同时还参与促进细胞增殖、抑制凋亡、调控组织炎症、肿瘤生长侵袭等过程[22]。SUI等[23]研究表明，CFTR蛋白可以通过增强PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而起到对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用，并抑制细胞自噬。Visfatin可参与人体的炎症和免疫反应，WU等[24]发现采用visfatin干预后，PI3K和p-Akt的表达上调，Akt的表达下调，PI3K/Akt信号通路被激活，因此认为visfatin可以通过调节自噬因子的表达来激活PI3K/Akt信号通路，从而降低急性肺损伤中的自噬水平。此外，还有研究表明对急性肺损伤的治疗，mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路同样起着重要作用[25]。

综上，本研究结果表明，三七抗急性肺损伤作用可能是通过槲皮素、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg1等活性成分发挥主要作用的，涉及的主要作用靶点有PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR等。推测三七可能是通过PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路等发挥对急性肺损伤的治疗作用。根据分析结果，本研究从三七的物质基础出发，着眼于整体角度分析三七抗急性肺损伤的分子机制，为后续研究提供一定的理论基础。但是，本研究主要是以生物信息学与海量数据计算的结果为基础，要明确三七的主要调控靶点还需要后续在此基础进一步筛选并进行动物或细胞实验进行验证。