抑癌基因ST5对乳腺癌的作用及其分子机制

陈东汉，曾玉英，陈 帅，赵 灿，黄 璐，郑小刚，李明莉，张志明，尤 俊，3

（1. 厦门大学附属第一医院，厦门 361003；2. 福建省宁德市闽东医院放射治疗科，宁德 352000；3. 福建医科大学附属厦门第一医院，厦门 361003）

乳腺癌具有明显的病理及分子特征异质性，基因表观遗传在其中可能起重要作用［1］。利用甲基化芯片比较正常乳腺及乳腺癌组织，发现后者存在大量表观基因改变［2］，提示表观遗传学事件在乳腺癌中可能具有重要作用。研究证实，基因启动子甲基化可通过影响细胞周期（如CCND2、CKN2A）、DNA修复（如BRCA1、GSTP1）、凋亡（如BCL2、DAPK）、侵袭和转移（如RASSF1A、RARβ、TWITE、HIN1）、转录调控（如HOXA 5）、细胞粘附（如CDH1）以及激素介导的细胞信号传导（如ERα、ERβ）等机制影响乳腺癌发生发展［3］。

ST5发现于筛选的HeLa细胞癌基因cDNA文库，是Hela/成纤维细胞杂交系统中差异表达的调控基因［4］。ST5又称为DENND2B，基因位于11号染色体短臂15.4位置，序列全长为217601bp，其中包含38个外显子。ST5开放阅读框片段长3414bp，可编码1137个氨基酸。ST5基因经转录形成三种大小不同的mRNA，分别编码分子量为126、82和70 kDa的蛋白亚型P126、P82和P70。已发现P126在MCF10A细胞上与Rab13结合，促进乳腺上皮细胞迁移及其致瘤表型［5-6］。ST5可抑制宫颈癌，但其在乳腺癌中的作用仍未知。本研究旨在通过探究ST5在乳腺癌中的作用及其潜在分子机理，为后续开发靶向药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料菌株E.coli DH5α和质粒PCDNA3.1、PCDNA3.1-ST5（ST5）以及人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468为本课题组持有。人乳腺癌组织样本由我院乳腺外科提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液培养，内含100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2 实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）提取新鲜乳腺癌和癌旁组织以及乳腺癌细胞总RNA。取2μg总RNA反转录成cDNA后进行PCR反应，检测GAPDH和ST5表达水平。GAPDH上游引物序列为5’-GTGACTAACCCTGCGCTCC-3’，下游引物序列为5’-GAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG-3’；ST5上游引物序列为5’-TACCTCCCCGAAGTCTCCTA C-3’，下游引物序列为5’-ACTTGGCAGTAAGCGCCTG-3’。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，60℃延伸30 s，40个循环；95℃变性30 s，60℃延伸30 s，95℃变性30 s，循环1个周期。反应结束后行2-△△Ct公式分析ST5 mRNA相对表达水平。

1.2.3 甲基化特异性PCR（methylation special PCR，MSP）提取乳腺癌细胞以及新鲜乳腺癌和癌旁组织总DNA，取1μg总DNA进行重亚硫酸盐转化及DNA纯化后获得甲基化DNA。以300ng甲基化DNA为模板进行PCR反应。通过MemthPrimer软件设计5对ST5的甲基化特异引物（表1）。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min，循环1个周期。反应结束后行琼脂糖凝胶电泳，采用Quantity One 4.6.2软件对电泳结果进行灰度值分析。

表1 MSP引物序列

1.2.4 质粒转染及筛选稳转细胞根据质粒提试剂盒说明书等常规操作进行质粒转染，并经WB和qPCR实验鉴定后筛选获得稳定表达细胞株MDA-MB-468/PCDNA3.1-ST5和MDA-MB-468/ PCDNA3.1。

1.2.5 siRNA瞬时转染乳腺细胞MCF7接种于6孔板中，细胞培养汇合度达30%时分成两组，根据EntransterTM-R4000转染说明书，分别加入适量质粒稀释液，放入CO2培养箱培养。

1.2.6 CCK8细胞增殖实验细胞接种于96孔板，继续培养24h、48h、72h后每孔加入10μL CCK8溶液，继续培养孵育3h，用酶联免疫检测仪检测波长450nm处各孔的光密度（D）值，以D值表示细胞增殖活力。

1.2.7 细胞凋亡实验细胞接种12孔板，培养48h后收集，PBS漂洗2次后，加入RNase A于30 ℃反应25 min，再加入PI于室温条件下反应25min，最后上流式细胞仪检测并自动分析制图。

1.2.8 蛋白质印迹（WESTERN BLOT）一抗为（ST5的稀释比例为1∶500；GAPDH、JNK、P-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38和β-tubulin的稀释比例为1∶1000），按照相关实验常规操作。采用Quantity One 4.6.2软件对各组电泳条带进行灰度值分析，并与内参做比值，统计各目标蛋白相对表达水平。

1.2.9 裸鼠成瘤实验20只4～5周雌性Balb/c裸鼠于厦门大学实验动物中心屏障环境内饲养。稳转的上述两组细胞皮下接种于裸鼠左前肢腋窝处；每6天监测肿瘤大小和裸鼠体重，40天后处死小鼠，取出肿瘤组织。

1.3 统计学方法所有实验均独立重复3次，结果数据以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0软件进行数据学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ST5在乳腺癌组织和细胞中低表达通过WESTERN BLOT、qPCR实验发现，相比癌旁组织，乳腺癌组织中ST5蛋白和mRNA表达水平均较低（图1）。

图1 ST5在乳腺癌组织低表达。（A）WESTERN BLOT实验检测ST5蛋白水平，（B）qPCR实验检测ST5 mRNA水平。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。P：癌旁组织，T：乳腺癌组织。

WESTERN BLOT及qPCR实验结果表明：与 MCF-7相比，恶性程度较高的MDA-MB-468细胞ST5蛋白和mRNA表达水平均较低（图2）。因此我们分别选用MDA-MB-468和MCF-7细胞进行后续生物功能和分子机制实验。

图2 乳腺癌细胞中ST5蛋白和mRNA表达水平。（A）WESTERN BLOT实验检测ST5蛋白表达，（B）qPCR实验检测ST5 mRNA表达水平。**P＜0.01。

2.2 探究乳腺癌低表达ST5的机制

2.2.1 乳腺癌中ST5基因高甲基化状态前期甲基化芯片数据分析提示，乳腺癌中ST5低表达可能由于ST5基因发生了甲基化。为验证之，采用甲基化特异性PCR（MSP）实验检测乳腺癌细胞MDA-MB-468中ST5启动区5’CPG岛甲基化状态。凝胶电泳结果显示第1-4对引物中M引物PCR扩增出条带，而非甲基化引物（U）则无，第5对U引物显示有微弱的条带，表明MDAMB-468中ST5基因启动区发生高甲基化（图3A）。用其中一对甲基化引物进行MSP实验检测4对乳腺癌组织/癌旁组织ST5的甲基化状态，结果显示第1、3、4对癌旁组织（P）有M和U条带扩增，癌组织（T）则具有明显的M扩增条带以及条带很弱或无U条带扩增；第2对癌旁组织（P）只有U条带扩增，癌组织（T）则两种条带均有扩增；说明癌旁组织ST5基因低甲基化或非甲基化，而乳腺癌组织ST5基因发生高甲基化（图3B）。

图3 MSP实验检测基因启动子甲基化状态。（A）乳腺癌细胞MDAMB-468的ST5甲基化水平，其中数字1/2/3/4/5表示第1/2/3/4/5对甲基化和非甲基化引物；（B）乳腺癌组织（T）/癌旁组织（P）ST5甲基化水平。其中数字1/2/3/4分别表示第1-4对T和P。M代表甲基化引物，U代表非甲基化引物。

2.2.2 检测去甲基化药物对乳腺癌细胞ST5表达水平的影响运用不同浓度去甲基化试剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza）处理乳腺癌细胞MDA-MB-468，发现随着5-aza浓度的增加，ST5表达量依次递增（图4），表明乳腺癌细胞MDA-MB-468中ST5基因发生高甲基化。

图4 不同浓度去甲基化试剂5-aza处理MDA-MB-468后，WESTERN BLOT 和qPCR实验检测ST5蛋白及mRNA表达水平。*P＜0.05。

2.3 ST5影响乳腺癌细胞增殖利用MDA-MB-468和MCF-7细胞分别构建ST5过表达（ST5）细胞和ST5敲减细胞（SIST5）模型。用CCK8实验检测培养0h、24h、48h、72h、96h后细胞增殖情况。结果显示上调ST5抑制MDA-MB-468细胞增殖（图5A），下调ST5促进MCF-7细胞增殖（图5B）。

图5 CCK8实验检测细胞增殖。（A）ST5过表达的MDA-MB-468细胞以及转染对照组细胞（PCDNA3.1），（B）ST5敲减的MCF-7及其对照组细胞（SINC）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 ST5影响乳腺癌细胞凋亡凋亡实验发现，上调ST5，早凋细胞和晚凋细胞分别从3.68%、4.08%增加到10.00%、11.3%，统计总凋亡率从7.76%增加到21.3%（图6A）；下调ST5，早凋细胞和晚凋细胞分别从5.66%、8.59%下降到2.50%、3.37%，统计总凋亡率从14.25%下降到5.87%（图6B）。表明上调ST5可促进乳腺癌细胞凋亡，下调ST5则抑制其凋亡。

图6 双染FITC-Annexin-V/PI实验检测乳腺癌细胞的凋亡。（A）过表达ST5和PCDNA3.1空载细胞的凋亡率，（B）为统计（A）中凋亡细胞的总百分比；（C）SIST5和对照细胞SINC的凋亡率，（D）为统计（C）中凋亡细胞的总百分比。*P＜0.05，***P＜0.001。

2.5 过表达ST5抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力利用前述构建的MDA-MB-468乳腺癌细胞进行裸鼠皮下移植瘤实验，结果显示过表达ST5抑制裸鼠移植肿瘤的生长（图7）。

图7 过表达ST5抑制Balb/c雌裸鼠移植瘤的生长。（A）过表达ST5的乳腺癌细胞及其对照细胞（PCDNA3.1）在裸鼠皮下生长情况；（B）取出移植瘤并称重，（C）接种10天后开始测量移植瘤的直径（长和宽），每6天测量1次。根据公式计算肿瘤体积V=（长×宽2）/2，（D）统计对比移植瘤的重量。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.6 探究ST5发挥抑癌功能的分子机制采用WESTERN BLOT检测MAPK信号通路关键蛋白（ERK1/2、JNK、P38等）的表达和活性。结果显示，过表达ST5抑制了ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平；反之，抑制ST5表达则促进了ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化，但ERK1/2和JNK的蛋白表达水平则无明显差异。但是，两种情况下，P38蛋白的表达和磷酸化水平均无明显变化（图8）。表明ST5可能通过抑制MAPK-ERK1/2和MAPK-JNK信号通路发挥抑癌功能。

图8 WESTERN BLOT实验检测过表达ST5（A）或抑制ST5（B）对乳腺癌细胞MAPK信号通路（ERK1/2、JNK、P38）相关蛋白表达和磷酸化水平的影响。

3 讨论

本研究首次发现ST5在乳腺癌中低表达，并通过使用去甲基化药物和甲基化特异性PCR实验证实了其原因可能为ST5基因启动子区发生高甲基化。进一步通过细胞增殖实验、凋亡实验和裸鼠皮下移植瘤实验等，系统揭示了ST5在体内外抑制乳腺癌的生物学功能。

MAPK可调节基因表达、细胞增殖、代谢、凋亡与免疫防御等生理过程［7-8］，其三级酶联反应包括：由MAPKKK使磷酪氨酸和磷苏氨酸残基脱磷，激活MAPKK，然后激活下游的MAPK［9］。MAPK家族成员包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-JUN N端蛋白激酶（JNK）和P38，因此MAPK信号通路主要包括ERK1/2、p38 和JNK1/2三条信号通路［10］。ST5蛋白的三个亚型共有一个C端区域，可与一组GDP/GTP交换蛋白质的Rab3家族的小GTP结合蛋白结合。ST5的全长产物P126蛋白质序列包含P-X-S/T-P扩展膜体，是MAPK磷酸激酶的最佳结合位点［11］。有文献报道，在宫颈癌中P126蛋白与c-Abl SH3结合，从而激活了MAPK/ERK 2信号通路，但ST5的另一产物P70则干扰c-Abl-P126复合物从而协同激活ERK2的活化［12］。本研究结果表明过表达ST5可下调ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平，而ERK1/2和JNK蛋白表达水平无明显改变，提示过表达ST5抑制了ERK1/2和JNK的磷酸化。我们推测ST5通过 N 端两个富含脯氨酸基序，与 GEF 竞争性结合衔接蛋白的 SH3 结构域，进而抑制下游的 ERK1/2 和JNK磷酸化，以封闭 MAPK 信号传递，从而抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，发挥抑癌基因的生物学作用。本研究首次发现并证实ST5具有抑制乳腺癌发生发展的生物学功能及其潜在的分子机制。