LncRNA-H19通过抑制miR-185-5p的表达促进成骨细胞的增殖

李 峰，刘翠中，伍 媛

（湖南师范大学第一附属医院/湖南省人民医院全科医学科，长沙 410005）

骨是由成骨细胞和破骨细胞动态调节的器官，它们在骨转换中起着重要的调节作用［1］。成骨细胞的主要功能是骨形成，而破骨细胞的主要功能是骨吸收［2］。成骨细胞和破骨细胞功能失衡导致多种骨代谢疾病，包括骨质疏松症［3］。骨质疏松通常伴随着成骨细胞的增殖分化功能下降，骨质流失等。成骨细胞诱导的骨形成在骨转换中起着至关重要的作用［4］。在骨重建过程中，一系列骨转换的标志物被释放出来［5］。越来越多的研究表明，诱导成骨细胞增殖是治疗骨疾病的重要策略。因此，揭示成骨细胞对增殖、凋亡和分化的调控机制具有重要意义。长非编码rna（long non-codingrnas，lncRNAs）是一种长度超过200个核苷酸的非编码rna（ncRNAs）。大量研究表明，lncRNAs在许多疾病中异常表达。它们能调节细胞增殖、凋亡和分化等关键过程，被认为是骨关节炎的新生物学标志物［6］。LNNA可能参与了成骨细胞的生长过程。然而，lncrna H19在成骨细胞表达变化的临床意义却鲜有报道。

miR-185-5p属于非编码的RNA分子，介导转录后基因的表达。先前的研究表明miR-185-5p受H19调控影响MC3T3-E1成骨细胞的分化。然而，miR-185-5p在成骨分化细胞中增殖的潜在调控机制尚不清楚。本文进一步探讨了lncRNA H19通过影响miR-185-5p表达对MC3T3-E1成骨细胞增殖的调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养研究用小鼠MC3T3-E1细胞购自上海创新生物技术有限公司（中国上海）。所有细胞在在5%的增湿空气中，以α-最小必需培养基（α-MEM；美国Invitrogen），1%青霉素（100 U/mL，Gibco），链霉素（100μg/mL链霉素，Gibco）在37°C和5%CO2条件下培养。然后，诱导MC3T3-E1细胞分化。对于miR-185-5P的表达抑制：miR-185-5p inhibitor（anti-miR-185-5p）和阴性对照（miRNC和anti-miR-NC）购自Ribobio（中国广州）。用脂质体3000（Invitrogen）导入MC3T3-E1细胞。转染后48小时，收集MC3T3-E1细胞进行进一步分析。

1.2 增殖活性检测用CCK-8试剂（DOJINDO，Kumamoto，Japan）观察细胞增殖活性。用特殊质粒或寡核苷酸处理的MC3T3-E1细胞在96孔板上培养，然后继续培养24h。每个孔加入10μL CCK-8溶液继续培养4 h。通过在微型板分光光度计（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）检测每个孔450 nm波长下的光密度，记录MC3T3-E1细胞的增殖活性。

1.3 western-blot法分离的蛋白质被印迹在膜上（聚偏二氟乙烯；美国马萨诸塞州贝德福德的milipore）。然后，在封闭1h后，用独特的一级抗体在4℃下孵育过夜。第二天，用相应的次级抗体与一级抗体结合，并结合信号通过添加增强化学发光试剂盒（milipore）的试剂出现。抗增殖相关抗原（PCNA，ab92552，1：1000，Abcam），ki67（OCN，1：1000，Abcam），GAPDH（ab9485，1：2500，Abcam）和山羊抗兔二级抗体（ab205718，1：5000，Abcam）用于本研究。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-PCR）MC3T3-E1细胞的总RNA通过TRIzol试剂（Invitrogen，USA）提取。用引物脚本一步法RT-PCR试剂盒（Takara，Japan）或miRNA逆转录试剂盒（GeneCopoeia，Guangzhou）合成LncRNA-H19或miR-185-5p的第一链互补DNA，用SYBR预混合二聚体清除试剂盒（Takara）检测LncRNA-H19、miR-185-5p的水平。用2-ΔΔCt法计算miR-185-5p和RNA-H19的表达水平，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内部对照。

1.5 双荧光素酶报告分析用starbasev3.0预测了miR-185-5p与H19的3' 非翻译区（UTR）的相互作用（http：//starbase.sysu.edu.cn/），合成了包含miR-185-5p潜在结合位点的H19序列片段，并将其嵌入载体中（美国威斯康星州麦迪逊市普罗梅加），分别命名为wt-H19与mut-H19。随后，将MC3T3-E1细胞与miR-185-5p或miR-NC与lipofectamine3000（Invitrogen）共同转染并在培养基中继续培养48h后，按照说明书的指示，用双荧光素酶报告试剂盒（Promega）分析荧光素酶活性。

1.6 数据分析每项实验至少重复3次，实验数据结果用mean±SD表示。运用SPSS 22.0软件，对每次试验三个独立的数据进行统计分析（α=0.05）。两组间差异性分析采用t检验。3组及以上组间差异分析采用单因素方差分析（ANOVA），2组间差异性比较采用Student’st检验.。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰H19对MC3T3-E1细胞增殖的影响对MC3T3-E1细胞进行瞬时转染shRNA，沉默H19的表达，将MC3T3-E1细胞分为sh-NC组与sh-H19组。qRT-PCR检测分析H-19的相对表达水平，结果显示：与对照组相比，sh-H19组H19的表达显著降低（P＜0.05）（图1）。ccK8检测细胞的增殖活性，结果显示：与对照组相比，sh-H19组MC3T3-E1细胞增殖活性显著降低（P＜0.05）（图1）。细胞内ki67蛋白反应细胞的增殖情况，westerton-blot检测，结果显示：与对照组相比，sh-H19组ki67表达水平显著降低（P＜0.05）（图1，C-D）。

图1 沉默LncRNA H19降低MC3T3-E1细胞增殖活性和ki67蛋白表达

2.2 干扰H19对AKT磷酸化的影响成骨细胞增殖受AKT磷酸化调控，为了探讨MC3T3-E1细胞中LncRNA H19对AKT磷酸化表达的影响，western blot检测结果显示：sh-H19组P-AKT表达水平显著降低（P＜0.05）（图2，A-B）。

图2 Western blot检测sh-H19对P-AKT的表达的影响

2.3 LncRNA H19对MC3T3-E1细胞中miR-185-5p表达的影响为了探讨MC3T3-E1细胞中LncRNA H19对miR-185-5p的表达的影响，运用生物学技术对LncRNA H19对miR-185-5p的序列进行预测，预测显示：LncRNA H19与miR-185-5p序列虽然存在高度差异，但是二者之间也存在序列互补性，即二者之间可能存在一定的靶向关系（图3，A）。沉默MC3T3-E1细胞中H19表达，qRT-PCR检测分析显示：MC3T3-E1细胞内sh-H19组miR-185-5p的表达水平显著降低（P＜0.05），即LncRNA H19对miR-185-5p的表达呈负调控（图3，B）。进一步验证二者之间的相互作用，荧光素酶报告试验显示：野生型H19结合miR-185-5p组的荧光活性显著低于H 19突变型结合miR-185-5p组（P＜0.05）（图3，C）。

图3 qRT-PCR检测LncRNA H19对miR-185-5p表达的影响

2.4 sh-H19 转染与miR-185-5p过表达对MC3T3-E1细胞中P-AKT表达的影响瞬时转染sh-RNA及添加miR-185-5p抑制剂后，western blot检测结果表明：miR-185-5p抑制剂组与miR-185-5p抑制剂+vector组的P-AKT表达水平跟对照组相比显著增高（P＜0.05），miR-185-5p抑制剂+ sh-H19组的P-AKT表达水平跟对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

图4 Western blot检测sh H19及miR-185-5p抑制剂对P-AKT表达的影响

2.5 sh-H19 转染及添加miR-185-5p抑制剂对MC3T3-E1细胞增殖的影响瞬时转染sh-RNA及添加miR-185-5p抑制剂后，qRT-PCR检测结果表明：miR-185-5p抑制剂组与miR-185-5p抑制剂+vector组的miR-185-5p表达水平显著降低（P＜0.05），miR-185-5p抑制剂+ sh-H19组的miR-185-5p表达水平与miR-185-5p抑制剂组相比显著升高（P＜0.05）（图5，A）。添加miR-185-5p抑制剂检测细胞增殖活性，结果显示：抑制miR-185-5p表达MC3T3-E1细胞增殖活性显著增加，miR-185-5p抑制剂+ sh-H19组细胞增殖活性miR-185-5p抑制剂组相比，显著降低（P＜0.05）（图5，B）。Western blot法检测MC3T3-E1细胞中调控增殖的蛋白ki67表达变化，结果显示：miR-185-5p抑制剂组与miR-185-5p抑制剂+vector组与对照组相比ki67表达增高（P＜0.05）；miR-185-5p抑制剂+ sh-H19组与对照组相比ki67表达无差异（P＞0.05）（图5，C）。

图5 CCK8，western blot法检测 sh H19及miR-185-5p抑制剂对增殖活性的影响

3 讨论

骨折是一种常见的疾病，由创伤引起，并伴有骨脆性。在美国，每年大约有600万成年人患有骨折［7］。骨折的愈合是一个复杂的生理过程，涉及生物和机械因素。成骨细胞是间充质细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化［8，9］。因此，揭示成骨细胞对增殖、凋亡和分化的调控机制具有重要意义。本研究发现：抑制LncRNA H19会抑制AKT的磷酸化，进而抑制成骨细胞的增殖。这对我们骨的增殖分化提供了新的临床思路。

长非编码rna（long non-coding RNAs，LncRNAs）是一种长度超过200个核苷酸，不编码任何蛋白质的rna，在多功能水平上调节基因表达。某些lncRNAs已被广泛用于不同疾病的诊断和治疗，具有潜在和临床实用价值［10］。先前的一项研究表明，lncRNAs可广泛存在于癌症和某些特定非肿瘤性疾病的血液样本（血浆或血清）中［11］。这为探索疾病的发病机制提供了一个新的方向。近年来，许多lncRNAs已被确认并被证明在各种疾病中发挥着重要作用，包括心血管系统疾病［12］、哮喘［13］、急性肾损伤［10］、糖尿病和骨质疏松［14］。LncRNAs在骨代谢中起重要作用，参与骨代谢的发育和转化，尤其是对成骨细胞增殖的调节中［15］。有研究表明，LncRNA H19可以通过激活Wnt信号来促进成骨分化，也可以通过粘着斑激酶（FAK）介导机械张力诱导的成骨作用［16］。我们的研究也发现，H19可以通过促进AKT磷酸化促进成骨细胞增殖。然而，H19在分化成骨细胞中的潜在作用有待进一步扩大研究。

MicroRNAs（miRNAs）是一种小的、非编码的RNA分子，介导转录后基因的表达。此外，miRNAs参与多种细胞过程［17］。越来越多的证据表明，一些miRNAs调节软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的分化过程［18］。这些发现表明miRNAs在骨形成、吸收、重塑和修复中起着不可或缺的中介作用［19］。Waki等人。据报道，与标准愈合骨折相比，一些miRNAs在不愈合骨折中显著上调，即miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p和miR-451a23。近年来，在骨折领域的研究已经证实miR-185-5p参与了成骨分化细胞矿质化。然而，miR-185-5p在成骨分化细胞中增殖的潜在调控机制尚不清楚。lncRNA-miRNA网络在调节细胞功能，包括骨代谢过程中起着重要作用。一项研究报告miR-185-5p通过Dlx2抑制作用与成骨分化相关［20］，这与我们的研究结果一致。根据恢复实验，miRNA-185-5p作为H19的下游介质，参与调节矿化相关基因的表达。已经证明，IGF1在成骨细胞成熟过程中促进成骨分化，并刺激成骨细胞增殖［21］。在目前的研究中，我们发现miR-185-5p负调控AKT的磷酸化，进而促进MC3T3-E1细胞增殖。总之，H19-miR-185-5p-AKT调控网络可能存在于成骨细胞的增殖分化过程中，H19通过ceRNA机制发挥作用。成骨细胞增殖促进细胞外基质矿化是成骨细胞骨形成的重要阶段。这些发现也为H19/miR-185-5p/AKT信号轴与成骨甚至骨疾病的关系提供了线索。

Akt是生命系统中一个重要的信号转导分子，可以调节细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运［22］。成骨细胞的生物学行为与细胞信号通路密切相关。其中PI3K/AKT信号通路对成骨细胞的增殖和矿化有重要作用。PI3K/AKT信号通路是代谢胰岛素作用的主要效应器，它参与一些基本的细胞过程，包括细胞增殖、矿化、糖异生、糖原合成等［23，24］。

综上所述，我们探讨了lncRNA H19在成骨细胞中的作用。下调H19通过调节miR-185-5p/AKT轴抑制成骨细胞增殖。这一发现将有助于了解骨折愈合的分子机制，为骨折患者的治疗提供新的思路。