肝癌与肺腺癌中FEN1的表达和预后分析

赵恒宇，郑浩青，黄河儒，李维嘉，吴振兴

（杭州医学院，浙江 杭州 310053）

0 引言

肝癌已成为人类第四大死因，目前我国肝癌发患者数约占世界肝癌发患者数的50%[1,2]。肝癌病例中有75%-85%为肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，LIHC）[3]。乙肝病毒、丙肝病毒、酗酒和马兜铃酸是LIHC的危险因素，这些因素将导致肝细胞损伤、炎症反应激活、细胞死亡以及肿瘤进展[4,5]。目前，LIHC缺乏早期诊断标志物和特异性治疗药物[6]。

肺癌死亡率最高的癌症，约85%的肺癌病例为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），而肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是NSCLC中最常见的类型[7,8]。吸烟是肺癌的主要危险因素[9,10]。由于目前医疗技术的局限，大量肺癌患者确诊时已为晚期[11]。

结构特异性核酸内切酶I（flap endonuclease 1，FEN1）基因定位于染色体11q12，在DNA复制、损伤修复、重组中起到重要作用[12,13]。有研究报道，FEN1过表达存在于多种肿瘤，提示FEN1过表达与肿瘤预后不良相关[14]。已有META分析证明FEN1与LIHC及LUAD相关[15-17]。

本研究使用ONCOMINE、DriverDBv3、人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas，HPA）、GEPIA、Kaplan-Meier Plotter和UALCAN等数据库和挖掘工具，探究FEN1表达在LIHC与LUAD中的预后价值。本研究也使用了STRING、Metascape、cBioPortal数据库等网络工具对FEN1进行蛋白互作分析、富集分析、突变分析。研究结果表明，FEN1是LIHC和LUAD的潜在诊疗与预后的生物标志物。

1 方法

1.1 FEN1表达差异分析

ONCOMINE（https://www.oncomine.org）是一个癌基因和癌基因组数据库[18]。为获取FEN1在肝癌和肺癌中及正常组织中的表达数据，我们设定数据将筛选条件如下：①Gene：FEN1；② Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③ Data Type: mRNA；④临界值设定条件：P<0.01，Fold Change>1.5，Gene Rank：10%。

DriverDBv3（http://driverdb.tms.cmu.edu.tw）是一个癌症组学数据库[19]。本研究使用DriverDBv3分析FEN1基因在原发性LIHC和LUAD中表达与在正常样本中表达的差异。

UALCA（http://ualcan.path.uab.edu）是一个交互式的癌症组学数据库，收录了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等多数据库资源[20]。本研究使用UALCAN分析FEN1在正常样品与肿瘤样品中差异表达。

HPA数据库（http://www.proteinatlas.org）是一个旨在构建细胞、组织、器官中蛋白质图谱的数据库[21-23]。本研究从HPA中下载肝癌、肺癌组织，以及正常肝组织、肺组织中免疫组化图片并对其进行分析。

1.2 FEN1表达差异的生存分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.htmL）是一个聚合了肿瘤样本和正常样本的RNA测序表达的数据库[24]。本研究利用GEPIA分析FEN1高表达与低表达对LIHC、LUAD患者生存的影响。

The Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com/analysis）是一个评估基因表达或突变对患者生存的影响的在线工具[25-27]。本研究使用该数据库验证了FEN1表达水平高低对肝癌和肺癌患者生存的影响。

1.3 FEN1的蛋白互作分析、富集分析、突变分析

STRING（https://string-db.org）是一个分析蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI）的数据库[28,29]。本研究使用STRING分析FEN1的20个相关蛋白的相互作用。

Metascape（https://metascape.org）是一个提供富集分析、PPI分析、基因注释等功能的在线工具[30]。本研究将STRNG中获取的20个FEN1相关蛋白进行功能富集分析。

癌症基因组学的生物门户（cBioPortal for Cancer Genomics，cBioPortal）是一个多组学数据库[31]。本研究使用cBioPortal评估FEN1突变对于患者生存时间的影响。研究中将筛选数据的条件设定如下：①Genomic Profiles：Mutation，copynumber alterations from GISTIC，mRNA Expression z-Scores（RNASeq V2 RSEM）；② z-score threshold：±1.8。

2 结果

2.1 FEN1在正常与肿瘤组织中的表达差异

对ONCOMINE数据库中肝癌和肺癌的芯片进行分析。与正常组织相比，FEN1在肝癌与肺癌组织中呈现高表达（图1A）。通过DriverDBv3分析，FEN1在原发性LIHC和LUAD中表达显著高于正常组织（图1B）。通过UALCAN数据库对TCGA中样本进行定量分析（图1C），FEN1在LIHC样品中表达显著高于正常组织（P<0.05），FEN1在LUAD样品中表达也显著高于正常组织（P<0.05）。通过分析HPA数据库中免疫组化图片，FEN1在肝癌与肺癌组织中均为高表达，在正常肝组织与肺组织中均为中表达（图1D）[21-23]。因此，FEN1在LIHC与LUAD中均存在高表达情况。

图1 FEN1在肝癌、肺癌、正常组织中表达差异分析

2.2 FEN1表达差异的生存分析

GEPIA数据库结果显示，FEN1表达水平与LIHC和LUAD患者预后相关（图2）。LIHC中FEN1高表达与患者总生存期（Overall Survival，OS）和无病生存期（Disease-Free Survival，DFS） 相 关（OS log-rankP=0.022，HR=1.5；DFS log-rankP=0.0075，HR=1.5）（图2A、B）。LUAD 患者FEN1高表达与OS相关，但FEN1表达高低对DFS造成的差异无统 计 学 意 义（OS log-rankP=0.027，HR=1.4；DFS log-rankP=0.63，HR=1.1）（图2C、D）。

我们使用Kaplan-Meier Plotter验证GEPIA结果，LIHC中FEN1高表达与OS和DFS相关（OS log-rankP=3.4e−06，HR=2.28；DFS log-rankP=0.0095，HR=1.54）（图2E、F）；LUAD患者FEN1高表达与OS和DFS也相关（OS log-rankP=0.00093，HR=1.66；DFS log-rankP=0.041，HR=1.75）（图2G、H）。

图2 FEN1表达差异的生存分析

综合两个数据库的分析结果，FEN1表达水平可作为预测LIHC和LUAD患者生存状况的标志物。

2.3 FEN1的PPI、富集、突变分析

通过STRING构建了FEN1及20个相关蛋白的PPI网络（图3A），在Metascape中进行了基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways，KEGG）分 析（图3B、C、D），FEN1及相关蛋白主要功能为DNA修复（GO：0006281）、DNA 链延伸（R-HSA-69190）、DNA 重组（GO：0006310）等功能。通过cBioPortal分析发现，FEN1突变情况对LIHC患者的DFS长短造成的差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 FEN1的PPI分析和富集分析

3 讨论

目前，肝癌和肺癌分别已成为中国人位居第三大、第五大的死因[32]。由于缺乏早期诊断标志物、预后标志物和靶向药物，肝癌和肺癌患者生存期较短[6,11]。因而寻找肝癌和肺癌的标志物及靶向药物，是肿瘤研究领域亟待解决的问题。

FEN1是5’核酸酶超家族成员，它参与了冈崎片段成熟、长碱基切除修复RNA引物在后随链复制中的移动、维持端粒长度等功能[33]。因此，FEN1为细胞正常运行提供必要的支持。

本研究分析了FEN1在LIHC和LUAD中的功能、表达及预后价值。其中运用了多组学对FEN1表达进行分析，发现FEN1在LUAD与LIHC中确实存在高表达。本研究还分析了FEN1表达高低对于患者生存期的影响。GEPIA数据库表明，FEN1高表达与LIHC预后不良相关；Kaplan-Meier Plotter数据库表明，FEN1高表达与上述两种癌症预后不良都有相关性。综上所述，FEN1表达水平也可作诊断与治疗的潜在标志物，可为医生制定治疗策略提供参考。研究也发现FEN1突变与LIHC患者无病生存期相关，提示FEN1突变情况可作为预测LIHC的潜在标志物。

尽管本研究通过多个数据库进行多组学分析，但仍存在着局限性。一是，FEN1的mRNA 表达差异样本量较小；二是没有使用META分析对FEN1在LIHC和LUAD中诊断价值进行评估。我们在近期聚焦于体外实验，以完善数据库分析所存在的不足，期待更好地说明FEN1表达与两种类型恶性肿瘤的相关性。但总的来说，FEN1可成为肝细胞肝癌和肺腺癌潜在的预后和诊疗生物标志物。