E2F转录因子家族对肝细胞癌诊断及预后价值的研究

宁晶璇

（山西省运城市中心医院内科，山西 运城，044000）

0 引言

在全球范围内，肝细胞癌是第7大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的第2大原因[1]。肝细胞癌因其起病隐匿、早期浸润生长并远处转移等特点使大部分患者就诊时已失去根治性手术机会，严重影响患者预后[2]。近年来已经开展了大量针对肝细胞癌分子靶向治疗及免疫治疗的研究，但是随着药物的临床运用，耐药率逐渐上升，肝细胞癌的总体发病率仍在不断增加[3]。因此研究肝细胞癌的发生发展机制，寻找肝细胞癌诊断和预后标志物及治疗靶点具有重要的意义。

E2F转录因子家族（E2Fs）是生物体中极其重要的一组转录基因，在细胞增殖、凋亡、分化、衰老、DNA损伤反应和DNA修复中发挥重要作用[4,5]。近年来研究发现一些E2F转录因子家族对多种恶性肿瘤发生发展的作用和特点[6-9]。本研究对肝细胞癌中8个E2F转录因子进行了深入而全面的生物信息学分析，并基于几个大型公共数据库评估了其作为诊断和预后生物标志物的潜力，从而为临床医生选择合适的治疗靶点和更准确地预测肝细胞癌患者的长期预后提综合数据。

1 资料与方法

1.1 分析E2Fs在肝细胞癌组织中转录表达水平及临床病理参数

UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/) 是一个基于TCGA数据库的在线分析和挖掘癌症数据的网站工具[10]。本研究通过运用UALCAN数据库检测分析E2Fs在肝细胞癌中转录水平表达以及其与肝细胞癌肿瘤分期和分级的关系。

1.2 分析E2Fs在肝细胞癌组织中蛋白表达水平

HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/) 是一个蛋白质数据库，旨在利用各种组学技术绘制人类蛋白质的组织和细胞分布信息[11]。本研究从人蛋白质图谱中寻找并提取了肝细胞癌组织和正常肝组织中E2F1/2/8免疫组化图像进行比较。

1.3 分析E2Fs与肝细胞癌患者预后的关系及检索E2Fs相似基因

GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/) 是一个基于TCGA基因表达数据动态分析和可视化的网站，提供肿瘤与正常组织的差异表达谱分析、病理分期、患者生存分析、相似基因的检测与分析[12]。本研究从GEPIA数据库中获得E2Fs在OS和RFS肝癌患者中表达的预后数据并进行统计学分析。同时利用GEPIA数据库检索E2Fs的相似基因进行富集分析。

1.4 E2Fs及其相似基因的GO和KEGG富集分析

DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/) 是一个生物信息数据库，目前的版本是david6.8，它可以为大规模的基因或蛋白质列表提供全面的生物功能注释信息，帮助用户从中提取生物信息[13]。本研究在david6.8数据库中用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes）对肝细胞癌中不同表达的E2Fs和160个相邻基因进行了富集分析。

1.5 统计方法

表达水平采用Student’s t-test，P<0.05提示有显著性差异。生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank检验法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E2Fs在肝细胞癌中的表达情况

为了解E2Fs在肝细胞癌组织中的表达情况，我们运用UALCAN数据库对肝细胞癌组织和正常组织中的E2Fs的mRNA水平进行比较。结果发现肝细胞癌组织中E2F1/2/3/4/5/6/7/8的mRNA表达量与正常组织相比明显升高（均P<0.001）（见图1）。接着我们应用HPA数据库探索E2Fs在肝细胞癌中的蛋白表达水平，在HPA数据库中我们找到了E2F1,E2F2和E2F8在内的3个E2F转录因子家族成员在肝细胞癌中的免疫组化结果，我们发现E2F1的蛋白表达水平明显高于正常组织，而E2F2和E2F8的蛋白表达水平与正常组织没有显著差异（见图2）。

图1 E2Fs 在肝细胞癌组织中的表达情况（＊＊＊P<0.001）

图2 E2F1/2/8在肝癌组织中免疫组化结果

2.2 E2Fs与肝细胞癌肿瘤分期和分级的关系

在发现E2Fs家族成员在肝细胞癌组织转录水平高表达后，我们利用UALCAN数据库分析E2Fs 转录水平与肝细胞癌肿瘤分期和分级的关系。结果提示：总体来说，在肝细胞癌肿瘤分期中E2Fs表达水平均随着肿瘤分期的增加逐渐升高。E2F1/2/3/6/7/8表达量均在3期最高，E2F4，E2F5表达量在肿瘤4期的表达量最高。（可能是因为肿瘤4期包含的样本量过于少的缘故。）在肿瘤分级中E2Fs的表达水平随着肿瘤分级的增加逐渐升高（见图3、图4）。提示E2Fs 转录水平随着肝细胞癌肿瘤分期和肿瘤分级的增加而升高，提示E2Fs的转录水平与肝癌患者的临床病理阶段明显相关。

图3 E2Fs与肝细胞癌肿瘤分期关系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001.

图4 E2Fs 与肝细胞癌肿瘤分级的关系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001

2.3 E2Fs与肝细胞癌患者生存期的关系

我们应用GEPIA数据库探索E2Fs的转录水平与肝细胞癌患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的关系。分析结果提示高表达E2F1/2/5/6/7/8的肝细胞癌患者的OS明显低于低表达的患者，而高表达E2F3/4的肝细胞癌患者的OS与低表达患者没有明显区别。对于RFS而言，高表达E2F1/2/3/5/6/7/8患者的RFS明显低于低表达者，而E2F4的表达与肝细胞癌患者的RFS无明显关系（见图5）。提示低表达E2F1/2/5/6/7/8的肝细胞癌患者OS和RFS预后较好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成为肝细胞癌的独立预后生物学指标。

2.4 E2Fs及其相似基因富集分析

接下来我们运用生物信息学中的比对思想，即与目标基因越相似的基因越有可能发挥相应的功能。利用GEPIA数据库寻找与E2Fs的相似基因160个（每个E2F成员找最相似基因20个，共160个相似基因）。利用DAVID数据库对E2Fs及其相似基因进行GO和KEGG分析。通过GO分析将靶标基因在细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物学过程（BP）中进行富集分析，通过统计学方法找到最显著富集的生物学注释。通过KEGG分析富集靶标基因产物在细胞中所在的通路。

GO分析结果提示：富集最多的细胞组分（GO:CC）是：细胞核、核质、细胞质、细胞质、细胞质、膜、核仁、中心体、微管及转录因子复合物；富集最多的分子功能（GO:MF）是：蛋白质结合、DNA结合、ATP结合、多聚（A）RNA结合、RNA结合、核苷酸结合、酶结合、微管结合、核心启动子结合、单链DNA依赖性ATP酶活性和DNA钳夹加载器活性；富集最多的生物学过程（GO:BP）是：细胞分裂、DNA复制、有丝分裂核分裂、DNA修复、mRNA剪接、通过剪接体、有丝分裂细胞周期的G1/S转换、细胞对DNA损伤刺激的反应、姐妹染色单体内聚、DNA损伤反应和p53类介导的信号转导导致细胞周期阻滞。

KEGG分析发现：在E2Fs及其相关基因可能通过参与细胞周期、癌中的MicroRNAs、DNA复制、错配修复、核苷酸切除修复等通路，参与肝细胞癌的发生和进展（见图6）。

图6 E2Fs及其相似基因富集分析结果

3 讨论

肝细胞癌是全球常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌大国，肝细胞癌的发病率和死亡率均超过全世界50%[14]。随着第一代肝细胞癌分子靶向药物多靶点酪氨酸酶抑制剂索拉菲尼上市，开启了肝细胞癌分子靶向治疗的新时期，PD-1单抗等免疫治疗药物被FDA批准上市运用于临床，为肿瘤晚期、无手术机会的肝细胞癌患者带来了希望[15]。但随着靶向药物的临床应用，耐药的发生率逐渐升高，上述分子靶向治疗药物及免疫治疗药物的整体有效率依然有限，诊断和预后的分子靶标依然缺乏。

近年来已有许多的研究评估E2F转录因子的表达在肝细胞癌中临床价值，但对E2F转录因子家族在肝细胞癌中的诊断及预后作用的研究仍不全面。本研究对E2Fs在肝细胞癌中的表达、肿瘤分期分级、预后等方面进行深入分析及研究，为临床寻找新型肝细胞癌诊断和预后标志物及治疗靶点提综合数据。

E2F1是经典的E2F转录因子家族成员，也是E2F家族中研究最深入的成员。它通过编码转录调节因子，在细胞周期G1期/S期转变过程中扮演着重要角色。本研究通过运用生物信息数据库分析发现E2F1 mRNA水平和蛋白水平在肝细胞癌中高表达，并且高表达E2F1的肝细胞癌患者具有更差的生存期。结果提示E2F1可能为肝细胞癌诊断及预后的标志物。E2F2是E2F转录因子家族成员之一，对细胞的增殖、分化和凋亡等相关细胞功能有一定的影响。有研究表明E2F2在肝细胞癌组织中表达上调，miR-218可通过抑制肝细胞癌中的E2F2,从而抑制肝癌细胞增殖[17]。本研究发现E2F2在转录水平在肝细胞癌组织中高表达，且其表达水平与肝细胞癌患者的生存期密切相关。本研究发现E2F3、E2F4mRNA在肝细胞癌组织中明显升高，但与肝细胞癌的预后无显著性差异，提示E2F3，E2F4对肝细胞癌的预后预测作用可能较弱。

近年来多项研究提示E2F5、E2F6、E2F7和E2F8在多种恶性肿瘤中发挥作用，其中有研究发现F2F5与CDK13相互作用促进前列腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡[19]；E2F6在恶性黑素瘤中高表达，敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭[20]。另外，Moreno等在对成年大鼠进行研究时发现E2F7是肝细胞癌生长抑制因子[7]；E2F8在甲状腺乳头状癌组织中高表达，且与其病理分期呈正相关[21]。本研究通过综合分析发现E2F5/6/7/8在肝细胞癌中高表达，且表达水平与肝细胞癌的临床分期及分级相关。低表达E2F5/6/7/8的肝细胞癌患者具有更高的生存期，提示E2F5/6/7/8同时具有诊断和预后预测作用。

综上所述，本研究通过分析E2F转录因子家族8个成员在肝细胞癌组织中的表达、与临床分期分级的关系、与肝细胞癌患者预后的关系，发现在转录水平上E2Fs在肝细胞癌组织中高表达，并且与肝细胞癌的临床病理分期明显相关。低表达E2F1/2/5/6/7/8的肝细胞癌患者OS和RFS预后较好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成为肝细胞癌的独立预后生物学指标。GO和KEGG富集结果提示E2F转录因子的功能主要集中在细胞周期调控方面，提示E2Fs可能通过细胞周期的转换促进肿瘤的发生发展。这些结果说明，E2F1/2/5/6/7/8可能作为肝细胞癌的独立生存预后指标，从而为临床中寻找肝细胞癌靶基因及靶向药物提供新的线索和思路。