环状RNA circ_0014359在神经胶质瘤中的表达水平及其临床意义

魏攀，周晓丰，李岩，王婷婷，吴悠悠

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性颅内肿瘤，其发生于神经外胚层组织，发病率约为8/10万[1]。目前临床对胶质瘤的治疗方法，主要包括手术治疗、放疗、化疗、免疫治疗及光动力学治疗等；但由于胶质瘤的恶性程度高、手术切除困难且术后易复发等原因，胶质瘤仍有极高的致残率和病死率[2-3]。因此，进一步研究胶质瘤的发病机制和新的治疗策略，开发新的肿瘤分子标志物和治疗靶点具有重要的临床意义。

环状RNA(circular RNA,circRNA) 是一类特殊的非编码RNA分子，最早发现于20世纪70年代，广泛存在于哺乳动物细胞中，是现今RNA领域的研究热点[4]。研究表明[5]，与传统的线性RNA不同，环状RNA分子呈封闭环状结构；因此，其不受RNA外切酶的影响，不易被降解。越来越多的研究发现，环状RNA分子富含多个miRNA结合位点，其可通过与疾病相关联的miRNA相互作用，可解除miRNA对其靶基因的抑制作用，而发挥重要的调控作用。已有很多文献报道，环状RNA分子在多种肿瘤中表达水平异常且其表达与肿瘤的发生发展密切相关。如Wei等研究发现，由Circ_CDYL驱动的非编码RNA调控网络在早期肝癌中具有特异性作用[6]；Geng等报道，hsa_circ_0009361作为miR-582的竞争性RNA，可通过调控APC2的表达抑制结直肠癌的进展[7]。此外，环状RNA分子circ_0007766通过上调细胞周期蛋白D1/CyclinE1/CDK4的表达，促进肺腺癌细胞的增殖[8]。circ_0014359是环状RNA分子之一，先前的研究表明circ_0014359在胶质瘤组织中表达上调，通过调控miR-153/PI3K信号通路促进胶质瘤的恶变[9]。本研究对联勤保障部队第940医院肿瘤科2012年3月—2015年8月收治的51例神经胶质瘤患者的胶质瘤组织及45例行颅内减压术患者的正常脑组织的circ_0014359表达水平进行检测，分析其与胶质瘤患者临床病理特征及预后的关系。旨在探讨circ_0014359在胶质瘤的表达水平及其临床意义，以及circ_0014359作为胶质瘤诊疗和预测预后的生物学标记物和潜在治疗靶点的可能性，为神经胶质瘤的预防、诊断以及治疗提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组51例脑胶质瘤患者中男27例，女24例；年龄35～72岁，平均年龄54.7岁；肿瘤WHO分级Ⅰ级者10例、Ⅱ级13例、Ⅲ级17例、Ⅳ级11例。患者均为首次手术治疗，经术后病理检查证实，术前未接受放疗、化疗，临床资料完整。另取45例颅内减压术患者的正常脑组织为对照组，其中男25例，女20例；年龄27～78岁，平均年龄52.5岁。本研究经医院伦理委员会同意，患者术前均签署知情同意书，昏迷患者则由其直系亲属代签。

1.2 方法

1.2.1 circ_0014359表达水平检测 手术切除的组织标本在15 min内立即放入-80 ℃液氮中低温保存，待成批检测。采用Trizol法(Invitrogen, CA, USA)提取组织标本中的总RNA。然后用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)测定其在波长260 nm及280 nm处的吸光度(OD)比值(OD 260/280)，计算RNA浓度并评估纯度；选择OD比值在1.9～2.0范围内的总RNA作为样本。用逆转录试剂盒将RNA样品逆转录为cDNA，再用实时荧光定量PCR仪检测胶质瘤和正常脑组织中的circ_0014359表达水平；内参照为GAPDH。然后采用2-ΔΔCt法对检测数据进行定量分析。所有实验均重复3次，操作均严格按说明书的步骤进行。

1.2.2 临床病理指标 观察统计患者的肿瘤直径、肿瘤位置、是否发生术后复发和淋巴结转移，以及Kamofsky功能状态(Kamofsky performance status，KPS)评分和肿瘤WHO级别，WHO分级Ⅰ-Ⅱ 级为低级别胶质瘤，Ⅲ-Ⅳ级为高级别胶质瘤。患者术后随访3年，观察统计患者的生存时间。

2 结 果

2.1 胶质瘤与正常脑组织circ_0014359表达水平比较 胶质瘤组织及正常脑组织circ_0014359表达水平的检测数据服从正态分布(P=0.721)。胶质瘤组织的circ_0014359表达水平(2.83±0.30)显著高于正常脑组织(0.97±0.24)，高级别胶质瘤组织的circ_0014359表达水平(3.52±0.30)又明显高于低级别胶质瘤组织(2.14±0.32)，差异均有统计学意义(P<0.001，P<0.05)。见图1。

2.2 临床病理指标与circ_0014359表达的关系 根据本组51例胶质瘤患者的平均circ_0014359表达水平(2.83±0.30)，将患者分为circ_0014359高表达组(23例)和低表达组(28例)。高WHO分级、淋巴结转移、KPS评分<80分及术后复发与circ_001435高表达有明显关系(P<0.05～0.005)；而年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径与circ_001435高表达均无明显关系(均P>0.05)。见表1。

胶质瘤与正常脑组织比较P<0.001；高级别与低级别胶质瘤比较P=0.011图1 低级别、高级别胶质瘤和正常脑组织的circ_0014359表达水平

表1 临床病理指标与circ_001435表达的关系(例)

2.3 circ_0014359表达与胶质瘤患者预后的关系 circ_0014359低表达组患者的术后3年生存率显著高于circ_0014359高表达组患者，差异具有统计学意义(P=0.049 3)。见图2。

2.4 胶质瘤预后的影响因素 采用单因素分析和多因素Cox比例风险回归模型对临床病理指标及circ_0014359表达与生存率进行分析。结果显示，circ_0014359高表达、高WHO分级、淋巴结转移、KPS评分低及术后复发是影响脑胶质瘤患者预后的独立危险因素。见表2。

图2 circ_0014359高表达组和低表达组患者的术后3年生存率

3 讨 论

神经胶质瘤是一种恶性程度极高、极具破坏性的原发性颅内肿瘤，根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类，神经胶质瘤被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个等级；其中以胶质母细胞瘤的恶性程度最高，患者预后最差，其中位生存时间只有12～15个月[10]。尽管近年来为了改善神经胶质瘤的预后进行了大量的研究；但由于胶质瘤手术切除困难且术后极易复发，胶质瘤患者的预后仍不理想[11]。虽然已经有大量的研究检测和验证一些与胶质瘤细胞侵袭和增殖相关的分子；但迄今为止，只有少数分子机制被揭示并转化为临床应用。因此，进一步研究胶质瘤的发病机理，探索新的肿瘤标志物和治疗靶点成为当前胶质瘤研究的重点。

表2 临床病理特征和circ_0014359表达与生存率的单因素及多因素分析

circRNA是一种内源性非编码RNA。越来越多的研究发现，circRNA通过作为miRNA的干扰RNA，与RNA结合蛋白结合、参与翻译等多种方式在肿瘤的发生发展中发挥多种生物学功能[12]。相关研究表明，由于circRNA缺乏5′帽子结构及3′ poly A尾，导致其表达更加稳定和保守；因此其可能作为肿瘤新的治疗靶点在多种肿瘤的治疗中起到重要作用[13]。如有研究显示，hsa_circ_0009361在结直肠癌中低表达，可通过影响miR-582进一步调控APC2的表达从而抑制结直肠癌的进展；hsa_circ_0009361低表达预示患者的预后不良[7]；此外在胃癌中，hsa_circ_0008035可通过靶向miR-375/YBX1轴参与肿瘤的发生发展[14]。Wang等研究发现，环状RNA VANGL1在非小细胞肺癌中表达水平上调，且通过抑制miR-195和激活Bcl-2促进肿瘤的进展[15]。而胶质瘤中也存在多种circRNA表达异常。Qu等研究显示，环状RNA circ_0079593在胶质瘤中通过干扰miR-182和miR-433促进细胞生长和侵袭，高表达的circ_0079593提示预后不良[16]。有文献报道，circ_0005198在胶质瘤中的表达水平显著增高，过表达的circ_0005198可调控胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭[17]。Li等研究表明，circ_0001946可通过调控miR-671-5p和CDR1，作为竞争性内源性RNA抑制胶质母细胞瘤的进展[18]。circ_0014359作为一种新发现的circRNA，有研究发现其在胶质瘤组织中表达水平明显增高，并且作为miR-153的竞争性RNA促进胶质瘤的进展[9]。然而，关于胶质瘤中circ_0014359表达水平的临床意义尚无文献报道。为此，本研究通过检测胶质瘤及正常脑组织的circ_0014359表达水平，探讨胶质瘤的circ_0014359表达水平及其临床意义。

本研究结果显示，胶质瘤组织的circ_0014359表达水平明显高于正常脑组织(P<0.001)，且高级别胶质瘤的circ_0014359表达水平明显高于低级别胶质瘤(P<0.05)，表明circ_0014359表达水平可能与胶质瘤的恶性程度密切相关。circ_0014359高表达与肿瘤高WHO分级、淋巴结转移、KPS评分低及术后复发有明显关系(P<0.05～0.005)，而与年龄、性别、肿瘤位置及直径无关(均P>0.05)。这进一步证实circ_0014359高表达与肿瘤的恶性程度及侵袭性有关，提示可通过抑制circ_0014359在肿瘤细胞中的表达而发挥抑癌作用。此外，生存分析显示circ_0014359高表达胶质瘤患者的3年生存率显著低于低表达患者(P<0.05)；单因素分析及多因素Cox比例风险回归模型分析显示，circ_0014359高表达是胶质瘤患者不良预后的独立危险因素。

综上所述，circ_0014359在神经胶质瘤组织中表达明显上调，且其表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关；circ_0014359高表达是预测胶质瘤患者预后不良的重要因素之一，提示circ_0014359可以作为胶质瘤诊断和预测预后的一种潜在的肿瘤分子标志物和治疗靶点。尽管目前对circ_0014359在胶质瘤的生物学作用尚不十分明确，但随着对circ_0014359的作用机制和参与调控信号通路的研究不断深入，可以为胶质瘤的预防、诊断和治疗提供新的思路与方向。