基因间长链非编码RNA00963 通过靶向miRNA-511-3p 调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

邹永妮，杨健，武君华

1西安天博医学检验实验室实验中心，西安 710018

2空军军医大学唐都医院血液内科，西安 710038

3西安市中心血站白细胞研究室，西安 710000

近年来胰腺癌的发病率和病死率不断升高，在过去的几十年中，胰腺癌患者的5 年生存率几乎没有变化，且胰腺癌的诊断和治疗仍然是一个巨大的挑战，生物标志物的应用有助于确定治疗方法，也为改善预后提供了机会。因此，探索胰腺癌的发展机制和新的治疗靶点具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等非编码RNA均在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和远处转移方面发挥重要的调节作用，其可用于胰腺癌的诊断和治疗，在临床中具有广阔的应用前景。研究报道，基因间长链非编码RNA00963（long intergenic non-protein coding RNA 963，LINC00963）在食管癌组织中的表达显著增加，且与食管癌的淋巴结转移、TNM 分期及不良预后有关；敲低LINC00963 的表达可抑制食管癌细胞增殖、体外侵袭及体内肿瘤生长。LINC00963表达升高与患者的预后不良有关，其可通过抑制miRNA-204-3p/纤连蛋白1（fibronectin 1，FN1）通路促进骨肉瘤的增殖和侵袭。LINC00963 通过使肿瘤抑制因子miRNA-542-3p 海绵化促进核仁蛋白2（nucleolar protein 2，NOP2）表达，从而促进前列腺癌的转移。然而LINC00963 对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及调控机制尚不清楚。在前列腺癌细胞系和人前列腺癌中，miRNA-511-3p 表达显著下调，慢病毒诱导的miRNA-511-3p 表达上调可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。研究表明，LINC02163 可通过抑制miRNA-511-3p 的表达促进结直肠癌的进展。然而LINC00963是否通过调控miRNA-511-3p 影响胰腺癌进展目前尚不清楚。因此，本研究旨在探讨LINC00963 对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其调控机制是否与miRNA-511-3p有关，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE 和胰腺癌细胞系Capan-1、SW1990 均购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，胰腺癌细胞系PaTu8988 购自上海雅吉生物科技有限公司。RPMI-1640 培养基购自上海高创化学科技有限公司，荧光定量试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司，RIPA 蛋白裂解液购自北京百奥莱博科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海易汇生物科技有限公司，Transwell 小室和Matrigel 均购自上海子起生物科技有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 细胞处理与分组

应用RPMI-1640 培养基常规培养正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE 和胰腺癌细胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988，分别将si-NC、si-LINC00963、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963、miRNA-NC、miRNA-511-3p、anti-miRNA-NC、anti-miRNA-511-3p 转染至Capan-1 细胞中，记为si-NC 组、si-LINC00963组、pcDNA-NC 组、pcDNA-LINC00963 组、miRNANC 组、miRNA-511-3p 组、anti-miRNA-NC 组、antimiRNA-511-3p 组；分 别 将si-LINC00963 与antimiRNA-NC、anti-miRNA-511-3p 共转染至Capan-1细胞中，记为si-LINC00963+anti-miRNA-NC 组、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p 组；正常培养的细胞作为NC 组。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测LINC00963和miRNA-511-3p 的表达水平

提取细胞总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒说明书进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），反应条件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 个循环。LINC00963 和miRNA-511-3p 分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和

U6

基因为内参。LINC00963 上游引物序列为5'-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3'，下游引物序列为5'-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3'；

GAPDH

上游引物序列为5'- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游引物序列为5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'；miRNA-511-3p 上游引物序列为5'-AGACAGAAAACGATGTGTAA-3'，下游引物序列为5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；

U6

上游引物序列为5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2法计算LINC00963 和miRNA-511-3p 相对表达量。

1.4 蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9 的表达水平

提取总蛋白，采用BCA 试剂盒定量，将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜、脱脂奶粉封闭，再分别加入一抗和二抗孵育，采用电化学发光液显影，成像后应用Quantity One 软件测定蛋白条带灰度值，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参计算cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量。

1.5 CCK-8 检测细胞增殖

将1.2 中的各组Capan-1 细胞培养24 h 后，添加10 μl CCK-8 溶液，孵育2 h，应用SpectraMax M5酶标仪检测450 nm 处的光密度（A）值，以A 值代表细胞活性。

1.6 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭

取1.2 中各组对数生长期细胞，采用无血清培养液重悬细胞。细胞迁移实验：将200 μl Capan-1细胞悬液和600 μl RPMI-1640 完全培养液分别加入至Transwell 小室的上室和下室，培养24 h 后应用多聚甲醛固定，并采用结晶紫染色，显微镜下观察并拍照，计算迁移细胞数目。细胞侵袭实验：采用Matrigel 包被Transwell 小室的上室，之后的操作与细胞迁移实验相同。

1.7 双荧光素酶报告实验检测LINC00963 和miRNA-511-3p 的靶向调控关系

构建含有miRNA- 511- 3p 结合位点的LINC00963 野生型及突变型报告基因载体，在Capan- 1 细 胞 中 转 染miRNA- 511- 3p mimics 和LINC00963 野生型及突变型报告基因载体，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 正常胰腺上皮细胞和胰腺癌细胞系中LINC00963 和miRNA-511-3p 相对表达量的比较

胰腺癌细胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988 中LINC00963 相对表达量均高于正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE，miRNA-511-3p 相对表达量均低于正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 不同细胞系中LINC00963 和miRNA-511-3p 相对表达量的比较（±s）

2.2 LINC00963 低表达对Capan-1 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

NC 组、si-NC 组、si-LINC00963 组Capan-1 细胞中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量及A 值、细胞迁移数目、细胞侵袭数目比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。si-LINC00963 组Capan-1 细 胞 中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量均低于si-NC 组，细胞活性（A值）低于si-NC 组，细胞迁移和侵袭数目均少于si-NC 组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（图1、图2、表2）

图1 Western blot检测NC组、si-NC组、si-LINC00963组Capan-1细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达情况

图2 Transwell实验检测NC组、si-NC组、si-LINC00963组Capan-1细胞的迁移和侵袭能力（结晶紫染色，×200）

表2 NC 组、si-NC 组、si-LINC00963 组Capan-1 细胞中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量及细胞增殖、迁移和侵袭情况的比较（±s）

2.3 miRNA-511-3p 高表达对Capan-1 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

miRNA-511-3p 组中miRNA-511-3p 相对表达量 明 显 高 于miRNA-NC 组，cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量均明显低于miRNA-NC 组，A 值明显低于miRNA-NC 组，细胞迁移和侵袭数目均明显少于miRNA-NC 组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表3、图3、图4）

图3 Western blot检测miRNA-NC组、miRNA-511-3p组Capan-1细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达情况

图4 Transwell实验检测miRNA-NC组、miRNA-511-3p组Capan-1细胞的迁移和侵袭能力（结晶紫染色，×200）

表3 miRNA-NC 组和miRNA-511-3p 组Capan-1 细胞中miRNA-511-3p、cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量及细胞增殖、迁移和侵袭情况的比较（±s）

2.4 LINC00963 靶向调控miRNA-511-3p 的表达

Starbase 预测显示LINC00963 和miRNA-511-3P 具 有 结 合 位 点（图5）。miRNA-511-3p 与LINC00963 野生型报告质粒共转染后Capan-1 细胞的荧光素酶活性明显低于miRNA- NC 与LINC00963 野生型报告质粒共转染后的Capan-1 细胞，差异有统计学意义（

P

﹤0.01），而miRNA-511-3p或miRNA-NC 与LINC00963 突变型报告质粒共转染后的细胞荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（

P

﹥0.05）（表4）。si-LINC00963 组中miRNA-511- 3p 相对表达量高于si- NC 组，pcDNALINC00963组中miRNA-511-3p相对表达量低于pcDNA-NC组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）（表5）。

图5 Starbase对LINC00963和miRNA-511-3p结合位点进行预测的示意图

表4 miRNA-NC 或miRNA-511-3p 与LINC00963 野生型及突变型报告质粒共转染Capan-1 细胞后双荧光素酶活性的比较（±s）

表5 不同组别Capan-1 细胞中miRNA-511-3p 相对表达量的比较（±s）

2.5 miRNA-511-3p 低表达可以逆转LINC00963低表达对Capan-1 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

anti-miRNA-511-3p 组中miRNA-511-3p 相对表达量低于anti-miRNA-NC 组，cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量均高于anti-miRNA-NC 组，A 值高于anti-miRNA-NC 组，细胞迁移和侵袭数目均多于anti-miRNA-NC 组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）；si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p 组中miRNA-511-3p 相对表达量低于si-LINC00963+antimiRNA-NC 组，cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量均高于si-LINC00963+anti-miRNA-NC 组，A 值高于si-LINC00963+anti-miRNA-NC组，细胞迁移和侵袭数目均多于si-LINC00963+anti-miRNA-NC组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（图6、图7、表6）

表6 anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-511-3p组、si-LINC00963+anti-miRNA-NC组、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p组Capan-1细胞中miRNA-511-3p、cyclin D1、MMP2、MMP9 相对表达量及细胞增殖、迁移和侵袭情况的比较（±s）

图6 Western blot检测anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-511-3p组、si-LINC00963+anti-miRNA-NC、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p组Capan-1细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达情况

图7 Transwell实验检测anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-511-3p组、si-LINC00963+anti-miRNA-NC组、si-LINC00963+antimiRNA-511-3p组Capan-1细胞的迁移和侵袭能力（结晶紫染色，×200）

3 讨论

胰腺癌是恶性程度最高的消化道肿瘤，具有发病症状不明显、早期诊断困难、进展迅速以及预后差等特点，且发病率呈逐年上升趋势，近年来分子靶向治疗在胰腺癌的治疗领域取得了一定进展，靶向治疗已成为治疗胰腺癌的新方法。研究表明，lncRNA 可参与胰腺癌的发生、发展和转移等生物学过程。研究报道，LINC00963 在乳腺癌组织中过表达，且与淋巴结转移、TNM 分期和分化程度有关；沉默LINC00963 的表达可通过调控miRNA-625-高迁移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进体外细胞凋亡。LINC00963 通过激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）途径促进肝癌细胞的增殖。LINC00963 通过miRNA-124-3p/卷曲蛋白受体4（frizzled class receptor 4，FZD4）途径促进结直肠癌的增殖和迁移。LINC00963 还能够通过miRNA-608/伏隔核蛋白1（nucleus accumbens associated 1，NACC1）途径促进黑色素瘤的进展，并且能够预测不良预后。以上研究表明，LINC00963 在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用。本研究结果显示，与正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE 比较，胰腺癌细胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988 中LINC00963 表达水平升高，表明LINC00963 在胰腺癌中也可能发挥促癌作用。本研究结果还显示，降低LINC00963 的表达水平后，cyclin D1、MMP2、MMP9 表达水平均降低，细胞活性降低，细胞迁移和侵袭数目均减少，表明LINC00963 低表达可以抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

研究表明，lncRNA 可通过调控miRNA 海绵化影响恶性肿瘤进展，如ZFPM2 反义RNA 1（ZFPM2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1）可通过调控miRNA-511-3p 参与肺腺癌细胞的增殖和迁移过程。ZFPM2-AS1 还能够通过调控miRNA-511-3p 影响宫颈癌的恶性程度。另有研究表明，LINC02163 能够通过调节miRNA-511-3p 的表达加速乳腺癌的恶性肿瘤行为。本研究结果显示，胰腺癌细胞系中miRNA-511-3p 低表达，提高miRNA-511-3p 的表达水平可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。此外，LINC00963 能够靶向调控miRNA-511-3p，miRNA-511-3p 低表达可以逆转LINC00963 低表达对Capan-1 细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

综上所述，低表达LINC00963通过靶向上调miRNA-511-3p的表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。