结直肠癌中循环肿瘤细胞的表达及与Ki-67 的关系研究△

林琳，李奇栋，张忠慧，孙利君，许庆文，徐飞鹏

广东医科大学附属医院胃肠外科，广东 湛江 524000

结直肠癌发病率居全球恶性肿瘤第三位，2020年全球癌症统计数据显示，中国结直肠癌新发56万例，病死29 万例。随着医疗技术的不断发展，结直肠癌诊断率和治疗效果明显提高，但由于结直肠癌患者的远处转移率较高，有研究发现，远处转移结直肠癌患者的5 年生存率明显降低，接受根治性手术的结直肠癌患者中，仍有20%～45%的患者可能出现复发或远处转移，由此可见，转移和复发是影响结直肠癌患者远期生存的重要因素，因此，深入探讨结直肠癌的复发转移机制，有助于结直肠癌的诊断和治疗。

1869 年，Ashworth 首次提出了循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，指实体肿瘤细胞在多种细胞因子的作用和调控下，从肿瘤组织脱落或进入循环系统，这其中绝大多数肿瘤细胞在免疫系统及自身凋亡的作用下死亡，只有极少数的肿瘤细胞能够存活下来，这些存活下来的细胞具有极高的侵袭性和转移倾向，其可发生黏附、聚集并在特定的条件下形成肿瘤微栓，实现肿瘤的侵袭和转移。随着科学技术的发展，使外周血CTC 检测成为可能。Ki-67 又称细胞增殖核抗原，因其只表达于增殖细胞中，表明其表达水平与细胞增殖密切相关。本研究采用CanPatrol二代检测技术分离富集和分析鉴定结直肠癌患者外周血中的CTC，检测结直肠癌中CTC 及其分型的表达情况，并分析CTC、mCTC、Ki-67 与患者临床特征的关系，分析结直肠癌患者CTC 及其分型的表达与Ki-67 表达的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年12 月至2019 年12 月广东医科大学附属医院收治的结直肠癌患者。纳入标准：均经内镜病理或手术切除病理明确诊断为结直肠癌，且均为初次诊断；均行标准结直肠癌根治手术治疗。排除合并其他系统恶性肿瘤的患者。依据纳入和排除标准，本研究共纳入230 例结直肠癌患者，其中男147 例，女83 例；年龄23～89 岁，中位年龄63 岁；TNM 分期：Ⅰ期27 例，Ⅱ期96 例，Ⅲ期107 例；肿瘤部位：升结肠63 例，降结肠19 例，乙状结肠58 例，直肠90 例；肿瘤最大径：≥5 cm 89例，﹤5 cm 141 例；分化程度：低分化58 例，中分化144 例，高分化28 例；浸润深度：T期10 例，T期28例，T期78 例，T期114 例；合并淋巴结转移107例，无淋巴结转移123 例；神经侵犯98 例，无神经侵犯132 例；脉管侵犯53 例，无脉管侵犯177 例。

1.2 方法

1.2.1 CTC 的检测方法 抽取230例结直肠癌患者空腹外周静脉血5 ml，置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）试管中，800～1000 r/min离心5～8 min，加入红细胞裂解液后再次离心，移除破碎的红细胞，加入4%多聚甲醛固定液固定10 min。使用由真空歧管连接装有8 μm 孔校准膜的过滤器和迷你台式真空泵过滤样本，压力为0.08 MPa，再次置于含4%甲醛的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）中固定60 min，完成CTC 的分离富集。CTC 的分型检测于24 孔板上进行，采用多重mRNA 原位分析法，使用多种特异性针对CTC 的RNA探针，分别对表达上皮表型基因[如上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CK8、CK18、CK19]的CTC 和表达间质表型基因[波形蛋白（vimentin）、twist]的CTC 以及区别CTC 和白细胞的特异性核酸探针（CD45）进行不同荧光染色标记。具体操作过程如下：对分离富集后的样本进行透化和消化处理，加入3 组探针工作液置于恒温培养箱中静置120 min，后进行预扩增（30%马血清、1.5%十二烷基硫酸钠、3 mmol/L pH=8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.5 fmol 预扩增序列）、扩增（30%马血清、1.5%十二烷基硫酸钠、3 mmol/L pH=8.0 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1.0 fmol的扩增序列）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色处理，以上步骤过程均使用PBS 冲洗3次，每次2 min。最后采用荧光显微镜观察并分析荧光信号。

1.2.2 免疫组化法检测Ki-67 表达情况 取230 例结直肠癌患者的结直肠癌组织，置于10%福尔马林固定液中固定24～48 h，清水冲洗后将其浸泡于不同浓度的乙醇溶液中脱水，经二甲苯透明，病理组织包埋机石蜡包埋，切片，厚度为4 μm。经过烤片、二甲苯、乙醇脱水及水化处理，加入柠檬酸修复液加热，冷却至室温，PBS 冲洗3 次，加入3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，PBS 冲洗3 次后滴加Ki-67 抗体，4 ℃孵育过夜；加入羊抗兔多克隆免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体，室温孵育30 min，PBS 冲洗3 次，DAB 显色，自来水重复冲洗2～3 次。苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片后，显微镜下观察染色情况。

1.2.3 结果判定 不同特异性探针杂交染色后，识别不同的荧光信号点，可将CTC 分为上皮型CTC（epithelial CTC，eCTC）、混合型CTC（biophenotypic CTC，bCTC）和间质型CTC（mesenchymal CTC，mCTC）（图1）。将结直肠癌患者外周血CTC≥3/5 ml判定为阳性，﹤3/5 ml 判定为CTC 阴性；eCTC、bCTC、mCTC≥1/5 ml 判定为阳性，﹤1/5 ml 判定为阴性；Ki-67 主要定位于细胞核，细胞核呈棕黄色染色判定为阳性。

图1 荧光显微镜下结直肠癌患者外周血CTC分型（荧光染色，×400）

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件对所有数据进行统计分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用

χ

检验，以

P

﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌患者CTC 表达情况

230 例结直肠癌患者中，207 例患者检出CTC，检出率为90%（207/230），其中159例检出CTC阳性，阳性率为69.13%（159/230）；CTC 计数0～143/5 ml，平均12.6/5 ml，中位5/5 ml。eCTC、bCTC、mCTC阳性率分别为50.00%（115/230）、66.96%（154/230）、71.30%（164/230）；不同TNM 分期结直肠癌患者CTC 表达情况结果显示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者CTC 阳性率分别为55.56%、64.58%、76.64%，mCTC 阳 性 表 达 率 分 别 为51.85% 、66.71% 、79.44%，CTC、mCTC 阳性表达率随临床分期的升高而逐渐升高（表1）。

表1 不同临床分期结直肠癌患者CTC 及其分型的阳性表达情况[n（%）]

2.2 不同临床特征结直肠癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表达情况比较

230 例结直肠癌患者中，Ki-67≥60%患者195例，Ki-67﹤60%患者35 例。不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、浸润深度、神经侵犯情况、脉管侵犯情况结直肠癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表达情况比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05）。不同分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期结直肠癌患者血清CTC 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=7.606、5.281、5.281，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期结直肠癌患者血清mCTC 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=14.852、6.471、6.471，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期结直肠癌患者结直肠癌组织中Ki-67≥60%表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=8.283、5.347、5.347，

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同临床特征结直肠癌患者的CTC、mCTC、Ki-67 表达情况

2.3 不同Ki-67 表达水平结直肠癌患者CTC 及分型阳性表达情况比较

Ki-67≥60%与Ki-67﹤60%结直肠癌患者CTC、eCTC、bCTC 阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05）。Ki-67≥60%结直肠癌患者mCTC 阳性表达率为73.85%（144/195），高于Ki-67﹤60%患者的57.14%（20/35），差异有统计学意义（

χ

=4.046，

P

﹤0.05）。（表3）

表3 不同Ki-67 表达水平结直肠癌患者CTC 及分型阳性表达情况比较

3 讨论

目前，结直肠癌的辅助诊断、疗效评估及预后监测手段主要包括血清肿瘤标志物[如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）]检测、影像学检查[如CT、MRI、超声、正电子发射计算机断层显像（position emission tomography，PET）-CT]、内镜及病理组织活检等。但上述检查手段或多或少存在着一些不足，CEA 水平升高表明消化道肿瘤、泌尿系肿瘤、乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的存在，但在结肠炎、胰腺炎等良性病变中也存在CEA 水平升高，长期合并心脑血管疾病、糖尿病等慢性疾病患者的血清CEA 水平也会升高，表明CEA 的特异度较低。CT、MRI、PET-CT 及内镜等影像学检查虽然能够直观地显示肿瘤病灶，但并不能及时发现隐匿性、转移灶或微小的术后残留病灶，具有一定的滞后性。组织活检是结直肠癌的诊断金标准，但存在多次反复取检、创伤较大、特殊部位难以取检、存在一定假阴性或无法动态监测的可能。因此，亟需寻找一种能早期发现肿瘤、动态监测疗效、预后评估的生物学指标。

本研究结果发现，肿瘤细胞经上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）后，其原有上皮表型的蛋白表达下调，而间质型表型的蛋白表达上调，即细胞发生细胞极性丢失，从而增强了细胞的运动能力，使其从原肿瘤组织脱落，或进入循环系统，形成CTC，为肿瘤的远处转移打下基础。Wong 等纳入132 例结直肠癌患者，结果发现，62%的患者呈CTC 阳性，且CTC 计数与淋巴结转移情况相关。吴志清纳入60 例结直肠癌患者发现，外周血CTC 阳性表达率与TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移情况、分化程度密切相关。葛祖荫等研究发现，低中分化结直肠患者的CTC阳性表达率高于高分化的结直肠癌患者。本研究纳入230 例结直肠癌患者，结果显示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者CTC 阳性率分别为55.56%、64.58%、76.64% ，mCTC 阳 性 表 达 率 分 别 为51.85% 、66.71%、79.44%，表明CTC、mCTC 阳性表达率随结直肠癌患者病情的进展而升高。此外，本研究结果显示，不同分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期结直肠癌患者CTC、mCTC 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05），表明CTC 及mCTC可能对结直肠癌患者的预后评估有重要意义。发生脉管侵犯的结直肠癌患者的mCTC 阳性表达率高达81.13%，高于无脉管侵犯患者的68.36%，虽然差异无统计学意义（

P

﹥0.05），但也提示，mCTC 可能参与结直肠癌的血行转移过程。Ki-67 由

MKI

-

67

基因编码，是一种存在于细胞核的非组蛋白，其不表达于细胞周期G期，而在G期开始表达，S 期及G期开始增加，至M 期达到顶峰，随后表达水平迅速降低，往复循环。有研究认为，Ki-67 的表达水平与细胞增殖密切相关，但其表达水平与结直肠癌患者临床特征的关系尚未完全阐明。赵岩等纳入50 例结直肠癌，结果发现，Ki-67 表达水平与淋巴结转移情况、分化程度及Dukes 分期有关，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤最大径和浸润深度无关。王晓元等的研究发现，Ki-67 的表达水平与浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移情况、脉管侵犯情况有关，而与年龄、性别、肿瘤最大径和分化程度无关。本研究结果发现，结直肠癌患者Ki-67 表达情况与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、浸润深度、神经侵犯情况、脉管侵犯情况可能无关，与分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期可能有关。表明Ki-67 在结直肠癌进展、侵袭转移过程中发挥重要作用，其表达水平较高提示肿瘤细胞的侵袭转移能力强，患者的预后不良。

本研究进一步探讨CTC 及其分型的表达与Ki-67 表达的关系，结果发现，Ki-67≥60%与Ki-67﹤60%结直肠癌患者CTC、eCTC、bCTC 阳性表达率无明显差异，但Ki-67≥60%结直肠癌患者的mCTC阳性表达率为73.85%，高于Ki-67﹤60%患者的57.14%。Gasinska 等的研究发现，恶性肿瘤细胞的EMT 可能与vimentin、N-钙黏素（N-cadherin）、Ki-67、survivin 的高表达及E-钙黏素（E-cadherin）和磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的低表达有关。此外，恶性肿瘤的发生发展过程中，常伴随肿瘤微环境的改变，其中肿瘤细胞过快增殖导致组织缺氧和肿瘤细胞坏死所致的炎性反应也是特征表现。而在缺氧的条件下，肿瘤细胞可通过缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）激活twist 的表达从而启动EMT过程。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）可通过JAK-信号转导与转录激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）通路诱导snail1 的表达来促进EMT 过程。上述研究均表明，Ki-67 高表达可能与EMT 密切相关，为证实Ki-67 表达与CTC 及mCTC 有关的假设提供了理论可能。

综上所述，结直肠癌患者外周血中检测到CTC 及mCTC 的表达提示肿瘤进展及潜在复发转移的可能，对评估患者的预后有一定的参考价值，Ki-67 表达水平与mCTC 的表达可能有关，但仍需进一步深入研究。