HPV E6/E7 mRNA与HPV-23分型检测用于宫颈脱落细胞学阳性女性的临床价值

杨文娟 叶君 陈炎 杨爱平

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球女性肿瘤第二位，大量研究数据显示近年来宫颈癌发病呈现年轻化的趋势[1-2]。高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染是导致女性宫颈癌的主要元凶[3-4]。HPV是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，基因组全长7 900 bp，有8个高度重叠的开放读码框，由早期基因（early gene，E）、晚期基因（late gene，L）和一个不翻译的上游调节区3部分组成。早期基因E1～E7分别编码E1～E7蛋白，其中E6和E7基因能使正常细胞向恶性转化。在HPV致癌作用过程中，病毒DNA融合可引起病毒基因E6和E7调节异常[5]。E6和E7蛋白可分别通过黏附肿瘤抑制因子p53和pRB基因使细胞生长抑制基因失活，从而导致细胞癌变。本研究对宫颈薄层液基细胞学检查（thinprep cytologic test，TCT）阳性患者的宫颈组织采用E6/E7及HPV-23分型检测，评估其在女性宫颈疾病诊治、宫颈癌筛查中的应用价值，为女性健康筛查措施制定、实施提供实验室理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2017年1月至2018年12月在浙江萧山医院妇科门诊的TCT结果阳性的患者360例，并均行经阴道镜下宫颈组织活检及病理学检查。排除近3 d内发生过性关系、妊娠或者哺乳期妇女、有阴道内用药、子宫切除术史、既往有宫颈手术或接受过盆腔放射治疗史的患者。根据病理活检结果（病理学分级）分为5组：宫颈癌患者17例，年龄28～74（47.56±14.27）岁；宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅲ级65例，年龄20～83（41.56±11.87）岁；CIN Ⅱ级60例，年龄23～62（39.35±9.55）岁；CIN Ⅰ级95例，年龄22～71（39.81±10.76）岁；慢性宫颈炎患者123例，年龄20～65（39.67±10.41）岁。5组患者年龄差异无统计学意义（F=1.21，P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 TCT检查及TBS分类 使用TCT检查的宫颈刷采集子宫颈细胞标本，深入宫颈采集移行带的宫颈脱落细胞。将已经刷取下脱落细胞的宫颈刷放入装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗，使细胞转移到保存液瓶中，并存放于4℃冰箱于2周内完成检测。TBS分类分为未见上皮内细胞病变（no intraepithelial lesions were found，NILM）、非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cell，ASC）、宫颈不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous epithelial cells of cervix，ASC-H）、低度鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鳞状上皮内病变（highly squamous intraepithelial lesions，HSIL）。

1.2.2 HPV基因分型检测（HPV-23分型） 根据相关试剂盒标本检测采集要求及实验室操作规程采集阴道分泌物，进行17种高危型检测：HPV 82、73、68、66、59、58、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56；6种低危型：HPV 83、81、6、11、42、43。采用亚能生物技术（深圳）有限公司的试剂盒（批号：Z-TD-0031-04），根据试剂盒操作说明书（PCR-反向点杂交法）检测HPV基因型别。所有型别中至少一个结果出现阳性定为HPV-23分型阳性，全部阴性定为HPV-23分型阴性。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测 采用河南科帝亚生物技术有限公司生产的E6/E7（支链DNA信号扩增方法）检测系统，定性检测人宫颈上皮脱落细胞中的16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型 别 的HPV E6/E7致癌基因片段信使RNA（mRNA）。不区分具体型别，采用化学发光法计算E6/E7的拷贝数。

1.2.4 宫颈组织活检及病理分级 在阴道镜直视下，经过醋酸白染色和碘染色，在病变明显处取组织送病理检查，病理学分级如下：（1）宫颈不典型增生：轻度不典型增生（CIN Ⅰ级）、中度不典型增生（CIN Ⅱ级）、重度不典型增生（CIN Ⅲ级）；（2）原位癌：癌细胞仅限于上皮内，基底膜完整，无间质浸润，属于CIN Ⅲ级；（3）早期浸润癌；（4）浸润癌，包括浸润性角化型鳞癌、浸润性非角化型鳞癌，浸润性小细胞癌。

2 结果

2.1 不同TBS分类标本E6/E7检测结果的比较 不同TBS分类中，ASC-H的E6/E7阳性率最高，为83.33%，LSIL、ASC-H、HSIL的E6/E7阳性率明显高于NILM、ASC。不同TBS分类E6/E7阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。TBS分级与E6/E7阳性率、E6/E7拷贝数均呈正相关（r=0.855、0.700，均P＜0.05）。

表1 不同TBS分类标本E6/E7检测结果的比较

2.2 不同病理学分级标本的E6/E7、HPV-23分型检测结果的比较 不同病理学分级中，NILM、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ、宫颈癌的E6/E7阳性率依次递增，差异有统计学意义（P＜0.05）。但HPV-23分型结果阳性率差异无统计学意义，见表2。病理学分级与E6/E7阳性率呈正相关（r=0.842，P＜0.05），与HPV-23分型无相关性（r=0.242，P＞0.05）。

表2 不同病理学分级标本E6/E7、HPV-23分型检测结果的比较[例（%）]

2.3 不同TBS分类患者HPV-23分型和E6/E7检测结果的一致性分析 不同TBS分类中，HPV-23分型和E6/E7检测结果完全一致280例，其中两指标均为阳性250例，两指标均为阴性30例；结果不一致80例，其中HPV-23分型阳性/E6/E7阴性75例和HPV-23分型阴性/E6/E7阳性5例，见表3。不同TBS分级HPV-23分型和E6/E7检测结果高度一致（Kappa=0.647，P＜0.05）。

表3 不同TBS分类患者HPV-23分型和E6/E7检测结果的一致性分析（例）

2.4 不同病理学分级患者HPV-23分型和E6/E7检测结果的一致性分析 不同病理学分级中，HPV-23分型和E6/E7检测结果完全一致284例，其中两指标均为阳性268例，两指标均为阴性23例；结果不一致69例，其中HPV-23分型阳性/E6/E7阴性58例和HPV-23分型阴性/E6/E7阳性11例，见表4。不同病理学分级HPV基因分型和E6/E7检测结果高度一致（Kappa=0.701，P＜0.05），见表4。

表4 不同病理学分级患者HPV-23分型和E6/E7检测结果的一致性分析（例）

3 讨论

流行病学资料调查显示，宫颈癌原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来研究显示其发病有年轻化的趋势[7]。HPV持续感染可显著增加宫颈癌发病的风险，临床上宫颈刮片、TCT、HPV基因高低危分型筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和病死率已有明显下降[8]。本研究结果显示，宫颈病变的TBS分类、病理学与HPV E6/E7 mRNA阳性率及其拷贝数均呈正相关，而与HPV-23分型阳性率无关。也就是说，大多数女性可有HPV感染史，且大多数为一过性感染，所以性生活活跃女性且伴有阴道炎体征仅仅HPV-23分型检测难以识别HPV感染为一过性或是长期感染，而导致假阳性率较高，影响诊断的准确性。随着TBS分级及病理学分级的加重，E6/E7阳性率及其拷贝数均明显升高。大量临床资料支持E6/E7拷贝数高的患者，其极有可能为高级别CIN诊断，张生枝等[6]研究结果也证实，在诊断CIN Ⅱ以上级别的宫颈病变上，E6/E7检测的特异性和准确性均显著高于HPV-23分型。E6/E7检测可排除HPV一过性感染导致假阳性率高的问题，所以TCT检查联合HPV-23分型、E6/E7检测可为宫颈癌的准确风险评估提供重要依据，已经成为临床常用的宫颈癌筛查手段[9]。

Kappa一致性分析结果显示不同病理学分级及TBS分类患者的HPV-23分型和E6/E7检测结果均高度一致（Kappa=0.647、0.701），但也存在部分患者HPV-23分型结果阳性而E6/E7阴性，说明虽存在HPV感染但未发生E6/E7基因的复制转录，该感染可能是一过性的，病情普遍较轻；部分患者HPV-23分型阴性而E6/E7阳性，均出现于病理学与TBS分级较高较重，相关机制有待进一步研究，可能原因如下：首先，HPV-23分型基因变异性较大，突变概率高，不同型别之间交叉变异等导致PCR-反向点杂交法中设计的特异性杂交探针失效；其次，HPV感染目前报道型别很多，而亚能公司提供的试剂盒只能检测常见的23种型别；再次，型别未涉及，这或许可以解释DNA阴性而mRNA阳性这一现象。进一步分析显示，随着病理学分级及TBS分级病情加重，HPV-23分型与E6/E7同时阳性的比例远远高于分级级别较轻者，差异有统计学意义（P＜0.01），董婕等[10]、王静等[11]也有相似的结论，针对健康人、CIN Ⅰ～Ⅱ、CIN Ⅲ，HPV DNA阳性率分别为25.6%、90.52%、93.33%、95.38%，E6/E7阳性率为8.5%、43.2%、63.8%、94.6%。HPV的感染与性生活开始年龄、活跃度、性伴侣多少直接相关，随着宫颈炎病情加重，HPV感染率保持在较高水平，而E6/E7基因的复制趋于活跃度与病情直线相关，所以随着临床症状的加重，HPV-23分型与E6/E7阳性率一致性越来越高[12]。

综上所述，E6/E7阳性率和拷贝数可作为预测宫颈病变的良好指标。定期接受HPV-23分型与E6/E7检测是女性宫颈癌筛查及发现宫颈疾病的重要实验室指标。当然，本研究尚存在许多不足之处：首先，本研究为单中心回顾性统计临床资料并进行总结分析，研究对象并不能完全覆盖整个杭州地区；其次，HPV感染除了与性生活直接相关外，还受其他因素的影响，如人群易感性和公众健康措施的不同等；再次，研究周期短，病例数有限，有待后续进一步深入的研究。