杨梅黄酮对皮肤光老化及NF-κB信号通路表达的抑制作用

谢璟 郑炎焱 徐晓敏 朱莉

皮肤光老化是指长期日光中的紫外线照射皮肤后引起的皮肤老化现象[1]。引起光老化的紫外线主要是长波紫外线（ultraviolet A，UVA），中波紫外线（ultraviolet B，UVB），其中，大部分UVB被皮肤表皮吸收，小部分UVB可到达真皮浅层，而UVA可穿透表皮直达真皮深处，并在细胞中长期累积[2]。长期紫外线辐射可导致机体产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），由于ROS的产生，体内氧化应激通路被启动，进一步激活核转录因子κB（NF-kappaB，NF-κB）信号通路表达，引起炎症损伤、胶原蛋白降解，甚至诱发皮肤癌[3]。当前，开发具有抗氧化活性的药物来抵抗紫外线的辐射并预防和延缓皮肤老化，已成为皮肤医学领域的研究热点。杨梅黄酮（Myricetin，Myr）是杨梅树中提取的黄酮类抗氧化剂，可以与金属形成螯合物，减少金属离子对氧化作用的催化活性、抑制氧化酶活性、减少α-生育酚自由基等方式发挥抗氧化作用。此外，Myr还具有多种生物学活性，包括抗癌、防癌、抗菌、抗病毒、抗炎等[4]。但目前，Myr对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制尚不清楚。本研究旨在通过建立小鼠和角质细胞光老化模型，初步探讨Myr对皮肤光老化及NF-κB通路表达的抑制作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料 选取雄性健康SPF级昆明小鼠50只，体重（30±2）g，鼠龄6～8周，购自温州医科大学实验动物中心。小鼠饲养在SPF级动物房内，每笼10只，自由摄食摄水，动物房室温控制在20～25℃，湿度60%，12 h明暗周期循环。本实验经温州医科大学动物伦理委员会批准。人皮肤角质形成（human keratinocytes，HaCaT）细胞购自中国典型培养物保藏中心；紫外线照射计和SS-03AB型紫外线光疗仪（UVA灯管6支≤20J/cm2；UVB灯管4支，≤5 J/cm2）购自中国上海SIGMA高技术有限公司；细胞培养基和FBS均购自美国Gibco公司；Myr购自中国西安开来生物技术工程有限公司；核转录因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IκB）-α和环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2抗体购自中国Proteintech公司；MTT试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司；青霉素、链霉素和胰酶购自美国Sigma公司；抗氧化指标检测试剂盒购自中国Solarbio公司；引物序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠光老化模型构建 光老化小鼠模型构建参考文献[5]：将光疗仪固定于暗室顶部，照射高度为30 cm；采用婴儿理发器剃除小鼠背部的绒毛，再用脱毛膏二次脱毛，然后采用随机数字表法分为5组，即空白对照组（未经紫外线照射和药物处理）、模型对照组（背部涂抹0.9%氯化钠溶液2 ml）、低剂量组（背部涂抹5 mg/ml Myr 2 ml）、中剂量组（背部涂抹20 mg/ml Myr 2 ml）、高剂量组（背部涂抹50 mg/ml Myr 2 ml），每组各10只；除空白对照组外，每组均隔日照射紫外线，照射前l h涂抹药物或0.9%氯化钠溶液，30 min后用棉签拭去残留药物；照射强度为UVB 0.18 mW/cm2，UVA 1.25 mW/cm2，第1周至第7周每次照射时间为30 min，以后每周照射时间延长10 min，12周时每次照射时间为80 min，直至14周终止（建模期间UVA照射计量累计达148.5 J/cm2，UVB照射计量累计达21.38 J/cm2）；定期观察各组小鼠背部皮肤皱纹生成、色素沉着、皮肤角化、毛细血管扩张等现象。

1.2.2 小鼠皮肤组织形态学检测 小鼠末次造模实验结束24 h后，采用戊巴比妥钠腹腔注射处死，取照射区部分皮肤组织，中性甲醛固定，乙醇系列脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成切片后分别进行HE染色和胶原纤维染色。

1.2.3 HaCaT细胞光老化模型构建 采用含10%FBS，100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5%CO2和20%O2条件下培养HaCaT细胞。将HaCaT细胞按2.5×106个/ml接种在6孔板中，2 ml/孔，培养24 h后，用PBS清洗细胞2次后并向每孔加入2 ml PBS，分别采用0、15、20、25、30 mJ/cm2UVB（发射峰为313 nm）处理细胞，每种剂量设8个复孔。采用MTT试剂盒检测各组细胞活性（操作严格按照试剂盒说明书），确定细胞半数致死剂量。按5×104个/孔接种细胞，培养24 h后，分别采用含0、5、15、25、35、50μM Myr的培养基（分别为0、5、15、25、35、50μM Myr组）培养细胞24 h，每个Myr浓度组做8个复孔。用PBS清洗细胞2次后并加入1 ml PBS，采用半数致死UVB剂量处理细胞，并以未经紫外线照射和药物处理细胞作为对照组，检测各组细胞活性。

1.2.4 抗氧化能力检测 去除小鼠背部照射区皮肤皮下脂肪并称重，制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液进行ROS水平测定。皮肤组织抗氧化能力检测指标包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutasea，SOD）水平、总抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）和羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）水平，严格按照试剂盒说明书操作。采用流式细胞术测定细胞内ROS水平，即各组细胞经胰酶消化并用1ml PBS重悬后，添加ROS细胞渗透性指示剂CM-H2DCFDA至终浓度1μM/ml，37℃暗室孵育30 min后，流式细胞仪检测活细胞内的ROS积聚情况。

1.2.5 IκBα和COX-2表达水平检测 采用Western blot法检测。使用细胞裂解液将细胞裂解后，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度；30μg蛋白上样，经15% SDSPAGE电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h；按照磷酸化（p）-IκBα、IκBα、COX-2和βactin说明书中建议的使用浓度，4℃过夜孵育PVDF膜；漂洗PVDF膜，加入二抗，室温孵育1.5 h后漂洗，并进行显影，Quantity One软件扫描各条带的光密度并分析结果。

1.2.6 IκBα和COX-2 mRNA表达水平检测 提取细胞和组织RNA后，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，qRT-PCR检测样本中的COX-2表达量。IκBα上游引物：5'-TGAGGACCAGCAGTGTCTTG-3'，下游引物：5'-CATCGTTGATCACAAGTCGG-3'。COX-2上游引物：5'-TAAGTGCGATTGTACCCGGAC-3'，下游引物：5'-TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT-3'。

2 结果

2.1 紫外线照射后小鼠皮肤外观及组织形态 空白对照组小鼠背部皮肤细腻光滑，皮肤色泽正常，富有弹性；皮肤结构、层次清晰，毛囊汗腺等完整可见，胶原纤维呈波浪状紧密排列，整齐有序，分布均匀，胶原束的走向大多与皮面平行。其余各组经紫外线照射8周后，均出现不同程度的皮肤粗糙增厚，纹理加深加宽，鳞屑增加，皮肤皱褶明显，毛细血管扩张现象。模型对照组表皮不规则增厚，伴有角化过度，真皮胶原纤维排列紊乱，胶原束散开，弹力纤维增多、扭曲，以毛囊周围增多较明显；不同剂量的Myr处理后，表皮厚度不一，与模型对照组比较，真皮胶原纤维变性程度轻，排列呈现不同程度的紊乱，弹力纤维有所减少。其中，以中剂量组光老化反应和组织病变程度最轻，皮肤稍粗糙增厚，表面有少许鳞屑，皮肤可见浅皱褶，毛细血管轻微扩张。组织病理显示表皮不规则增厚，伴有角化过度，真皮胶原纤维排列较紊乱，胶原束部分散开。见图1（插页）。

2.2 紫外线照射后各组小鼠皮肤抗氧化能力及IκBα和COX-2 mRNA表达水平比较 见表1。

由表1可见，经紫外线照射后，各组小鼠皮肤组织抗氧化指标（SOD、T-AOC和HYP）及NF-κB信号通路相关指标（IκBα mRNA、COX-2 mRNA）差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型对照组比较，低剂量组和高剂量组T-AOC活性升高，中剂量组SOD活性升高，低剂量组COX-2 mRNA表达水平降低（均P＜0.05）；与空白对照组比较，中剂量组SOD活性、T-AOC活性和HYP水平均升高，而IκBα mRNA表达水平降低（均P＜0.05）。

表1 紫外线照射后各组小鼠皮肤抗氧化能力及IκBα mRNA和COX-2 mRNA表达水平比较

2.3 紫外线照射后各组小鼠HaCaT细胞活性和ROS水平比较 见图2。

图2 紫外线照射后各组小鼠人角质形成（HaCaT）细胞活性和活性氧（ROS）水平比较（a：各组小鼠HaCaT细胞活性比较；b：各组小鼠细胞内ROS积聚水平比较；与对照组比较，*P＜0.05；与0μM Myr组比较，△P＜0.05）

由图2可见，随着UVB剂量的增加，HaCaT细胞的活性逐渐降低，半数致死剂量约为20 mJ/cm2，其细胞活力为无UVB照射时的（58.60±9.07）%。在20 mJ/cm2UVB照射条件下，HaCaT细胞的活力随着Myr处理浓度升高而上升，当Myr浓度达到35、50μM时，细胞活性分别为对照组的（72.20±8.26）%和（85.80±4.97）%，与0μM Myr组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。UVB照射后，细胞内ROS水平均不同程度升高，但Myr可抑制ROS上调，与对照组比较，当Myr浓度为35、50μM时，组间ROS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 紫外线照射后各组小鼠HaCaT细胞IκBα和COX-2表达水平比较 见表2、图3。

由表2、图3可见，经紫外线照射后，与对照组比较，0μM Myr组p-IκBα、IκBα蛋白、IκBα mRNA、COX-2蛋白及COX-2 mRNA表达水平均升高（均P＜0.05），50μM Myr组p-IκBα蛋白、IκBα mRNA、COX-2蛋白及COX-2 mRNA表达水平均降低（均P＜0.05）。

图3 加入杨梅黄酮（Myr）紫外线照射后皮肤磷酸化核转录因子κB抑制蛋白（p-IκBα）、核转录因子κB抑制蛋白（IκBα）和环氧化酶（COX）-2蛋白表达的电泳图

表2 紫外线照射后各组小鼠HaCaT细胞IκBα和COX-2表达水平比较

3 讨论

高达80%～90%的皮肤老化是由于环境和外来生物制剂（外部老化）造成的，而长期紫外线照射是皮肤老化的主要原因[6-7]。紫外线照射皮肤数小时后，炎性细胞在皮肤表皮和真皮局部浸润，并产生大量的ROS。ROS细胞内聚积可以破坏细胞膜结构、引起DNA突变和蛋白变性，进而影响细胞结构并导致功能障碍[8]。而长期由ROS诱导的氧化应激反应不仅会导致机体氧化损伤，还将通过DNA损伤和激活癌基因的方式促进基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等疾病发生[9]。寻找一种安全、高效的抗氧化剂，对于预防和延缓皮肤光老化有着重要意义。

Myr又称3,5,7,3',4',5'-六羟基黄酮，是一种天然安全的黄酮类化合物，相较于其他同类化合物，具有更强的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化活性[10-11]。现有的Myr研究主要集中于肿瘤[12]、神经退行性病变[13]、心血管疾病[14]等领域，在皮肤光老化的防治方面研究仍较为缺乏。本文结果显示，Myr可有效抑制紫外线对小鼠皮肤的组织学病变和胶原纤维变性，并上调胶原蛋白特征性氨基酸HYP水平。ROS在皮肤聚集将持续消耗皮肤抗氧化物质，其中SOD是体内主要的抗氧化酶，其作用主要是清除超氧化物自由基，而T-AOC代表了机体清除ROS的能力[15-16]。本研究通过对不同剂量Myr处理后的皮肤组织检测发现，Myr不同程度提高组织SOD和T-AOC活性。其中，相比模型对照组，20 mg/ml Myr可显著提高小鼠皮肤抗氧化能力。角质形成细胞是皮肤抵抗紫外线的首要屏障，在光老化的发生和发展中起重要作用。本文通过角质形成细胞光老化模型也证实，Myr可有效抑制UVB对HaCaT细胞的杀伤作用和ROS细胞内聚集。提示Myr可通过提高皮肤抗氧化的能力来延缓皮肤光老化。

当细胞受到外界的刺激使其会发生反应，首先通过细胞表面的一些受体或者蛋白将细胞外信息传递到细胞内，随后细胞根据传递到细胞内部的信息，细胞内部一系列的蛋白分子与生理功能被激活，称这些蛋白分子构成的网络为信号通路。紫外线照射后NF-κB信号通路被激活是晒伤引起炎症反应的第一步。COX-2是NF-κB的一个下游靶点，因此，笔者推测Myr可能是通过NF-κB信号通路来发挥抑制紫外线辐射对人角质细胞的损伤作用。为了验证这一假设，本研究将HaCaT细胞用20 mJ/cm2紫外线照射，然后用Myr处理细胞，之后收集细胞蛋白，用Western blot检测细胞p-IκBα和IκBα蛋白表达。结果发现，紫外线照射后细胞内的p-IκBα水平表达显著上调，IκBα未产生明显变化，当采用50μM的Myr处理细胞，发现p-IκBα表达被抑制，IκBα仍未产生显著的变化。因此，笔者得出结论Myr可能是通过NF-κB信号通路来发挥抑制紫外线照射对细胞的损伤作用。多种信号通路都可通过降解IκBα的方式活化NF-κB，主要是使IκBα的丝氨酸残基发生磷酸化。活化后的NF-κB可以入核与DNA结合发挥其转录调控功能。IκBα首先是在IκBα激酶的作用下发生丝氨酸残基磷酸化，接下来IκBα在E3泛素化酶复合体催化下进行泛素化而被蛋白酶降解。活化后的NFκB参与机体多种调控机制，主要是发挥转录活性功能，诱导下游基因的转录。经典的NF-κB信号通路主要由p50/p65介导，在未激活状态下，p50/p65与抑制因子IκBα结合形成蛋白复合体存在于细胞质中，当蛋白复合体受ROS、TNF、IL-1等刺激，将引起IκBα磷酸化并与p50/p65解离，进一步诱导p50/p65入核，启动下游炎症相关蛋白COX-2的表达[17-18]。本研究进一步检测Myr对小鼠和细胞IκBα和COX-2的作用表明，Myr可有效抑制紫外线对皮肤组织和细胞的IκBα和COX-2的上调作用，下调IκBα磷酸化水平，提示Myr可通过NF-κB信号通路抑制紫外线照射的损伤作用。

综上所述，本研究通过动物和细胞实验证实，Myr可提高皮肤抗氧化能力，通过调控NF-κB信号通路发挥抗炎活性，具有抑制紫外线诱导的皮肤光老化作用。