H型高血压患者脑卒中危险因素及CACNA1C基因多态性与血清同型半胱氨酸水平的关系研究

晏峰 钟益芳 任振唤 戴数 周颖 胡云良

有研究发现，我国高血压人群的同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平明显增高，这类合并高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）的原发性高血压被称为H型高血压[1]。有研究分析高血压患者基线Hcy水平后发现，以Hcy≥10μmol/L作为标准，伴有HHcy的高血压（即H型高血压）患者比例高达75%～80%[2-3]。相关研究证实H型高血压也是发生脑卒中的重要原因之一，可使患者发生脑卒中的风险比达11.3，是健康人群的25～30倍[4]，因此认为高血压和HHcy对脑卒中的发生可能具有协同作用。另有研究显示L型钙离子调节通道与原发性高血压的形成密切相关，钙离子通道a1c亚基是形成L型钙离子通道的中心孔蛋白，L型钙通道亚基基因CACNA1C突变易导致钙离子通道主要功能丧失，这种功能丧失可能导致高血压的发生[5-7]，Beitelshees等[8]认为基因CACNA1C多态性与血管内皮细胞抗氧化能力变化有关，影响动脉粥样斑块的生成以及高血压、脑卒中的发生。Yokoyama等[9]认为CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位点多态性对血管痉挛、内皮细胞功能有影响。因此，本研究通过测定CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位点的多态性，探讨H型高血压患者脑卒中的危险因素及CACNA1C基因多态性与Hcy之间的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年11月至2019年1月丽水市人民医院收治的高血压患者1 096例。纳入标准：（1）高血压诊断标准符合中国高血压防治指南（2018修订版）[10]；（2）HHcy符合《中国高血压指防治南2018》中规定Hcy≥15μmol/L，或正在接受降低Hcy治疗患者；（3）签署患者知情同意书。排除标准：（1）3个月内发生过急性心脑血管事件；（2）确诊继发性高血压；（3）有严重精神障碍，无法表达意愿；（4）出现其他明显异常体征、临床疾病和实验室检查结果，不适合参加研究。根据血清Hcy水平分为H型高血压组823例（血清Hcy水平≥15μmol/L）和单纯高血压组273例。其中H型高血压组男486例，女337例，平均年龄（65.12±11.53）岁；单纯高血压组男174例，女99例，平均年龄（62.52±9.42）岁。H型高血压患者根据是否合并发生脑卒中分为H型高血压脑卒中组（简称脑卒中组）112例和H型高血压非脑卒中组（简称非脑卒中组）711例，脑卒中组男64例，女48例，平均年龄（66.87±10.22）岁，非脑卒中组男422例，女289例，平均年龄（64.52±11.14）岁。脑卒中诊断标准[11]：（1）急性发病的局灶性神经功能缺失，少数可为全面性神经功能缺失；（2）头颅CT/MRI检查证实脑部相应梗死灶，或症状、体征持续24 h以上，或在24 h内死亡。选择2019年3至6月本院健康体检者355例作为对照组，男219例，女136例；平均年龄（61.78±9.88）岁。纳入标准：（1）未服药情况下收缩压＜140 mmHg，舒张压＜90 mmHg；（2）排除有心脑血管病或心脑血管病史者以及有脑卒中家族史者。各组对象性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审批同意。

1.2 方法 采用问卷调查方式记录各组对象的性别、年龄、收缩压、舒张压、糖尿病、血脂异常、短暂性脑缺血发作（TIA）、房颤、饮酒、吸烟、缺乏锻炼、心脑血管疾病家族史、BMI等临床资料。

1.3 观察指标 采集所有对象的空腹外周血6 ml，其中2 ml加入EDTAK2抗凝管中，于-70℃冰箱冷冻保存，准备抽提DNA。其余4 ml用于测定血脂、TC、TG、HDL-C、LDL-C、脂蛋白（a）[Lp（a）]、Hcy、FPG等水平。H型高血压组患者根据Hcy水平分为A组608例（Hcy＜20μmol/L），B组147例（Hcy 20～30μmol/L），C组48例（Hcy＞30μmol/L）。

1.4 DNA的提取及分型

1.4.1 DNA的制备 采用细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法提取基因组DNA。

1.4.2 PCR引物合成 PCR引物由SEQUENOM公司软件Assay Design Design 3.1设计，由北京擎科公司合成，见表1。

表1 5个SN P位点的P CR引物及延伸引物

1.4.3 PCR扩增及单核苷酸多态性（SNP）位点分型 采用多重PCR技术对目的序列进行扩增，完成所选SNP位点基因序列的扩增。将上述扩增产物中加入ddNTP，并通过延伸引物（约20 bp）只能延伸一个碱基的特点，来实现SNP位点的扩增。延伸结束后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）基因分型技术，进行SNP位点分型。

2 结果

2.1 各组对象临床资料的比较 高血压各组与对照组比较，在收缩压、舒张压、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、饮酒、吸烟、缺乏锻炼、BMI的差异均无统计学意义（均P＞0.05），而TIA、房颤、心脑血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）的差异均有统计学意义（均P＜0.05）；非脑卒中组及脑卒中组与单纯高血压组比较，TIA、房颤、血清Hcy、Lp（a）水平的差异均有统计学意义（均P＜0.05）；脑卒中组TIA、心脑血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）均高于非脑卒中组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 各组对象临床资料的比较

2.2 H型高血压患者发生脑卒中的危险因素分析 以H型高血压患者是否出现脑卒中为因变量，以性别、年龄、收缩压、舒张压、吸烟、BMI、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、TIA、房颤、饮酒、吸烟、缺乏锻炼、心脑血管疾病家族史及Hcy为自变量，多因素logistic回归分析结果显示：年龄、收缩压、TIA、房颤、心脑血管病家族史、Lp（a）及血清Hcy水平是H型高血压患者发生脑卒中的独立危险因素，见表3。

表3 H型高血压患者发生脑卒中的危险因素分析

2.3 血清Hcy水平与脑卒中患病率的关系 H型高血压各组随着患者血清Hcy水平升高，脑卒中患病率呈增高趋势，组间两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表4。血清Hcy水平与脑卒中患病率呈正相关（r=0.171，P＜0.01）。

表4 不同血清Hcy水平3组H型高血压患者脑卒中患病率的比较（例）

2.4 CACNA1C基因多态性分析 高血压各组和对照组CACNA1C 5个SNP位点基因型分布经χ2检验，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明4组患者具有群体代表性。

2.4.1 CACNA1C 5个SNP位点基因型峰图 见图1-5（峰的部位为多态性位点，单峰表示纯合子，双峰表示杂合子）。

图1 r s215976分型后3种基因型峰图（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

图2 r s1051375分型3种基因型峰图（a：A/A型；b：G/A型；c：G/G型）

图3 r s2299661分型后3种基因型峰图（a：C/C型；b：C/G型；c：G/G型）

图4 r s1084683分型后3种基因型峰图（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

图5 r s216008分型后3种基因型峰图（a：T/T型；b：C/T型；c：C/C型）

2.4.2 各组对象CACNA1C的不同位点基因型及等位基因分布频率的比较 高血压各组CACNA1C的rs2299661位点的基因型CC频率均高于对照组（均P＜0.05），脑卒中组与单纯高血压组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；脑卒中组CACNA1C的rs2299661位点的C等位基因频率高于非脑卒中组、单纯高血压组及对照组（均P＜0.05）；非脑卒中组、单纯高血压组及对照组两两比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976各SNP位点基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表5、6。

表5 各组对象CACNA1C的不同位点基因型分布频率的比较[例（%）]

表6 各组对象CACNA1C的不同位点等位基因频率的比较[例（%）]

2.4.3 rs2299661 C/G不同基因型（CC型、CG型、GG型）携带者临床资料的比较 rs2299661 C/G 3种不同基因型携带者之间的年龄、收缩压、舒张压、BMI、TIA、房颤、饮酒、吸烟、缺乏锻炼、心脑血管病家族史、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），而Lp（a）和Hcy水平差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两两比较显示CC型和CG型患者的Lp（a）和Hcy水平明显高于GG型患者（均P＜0.05），见表7。对脑卒中组患者的rs2299661C等位基因携带者（CC+CG基因型）与非携带者（GG纯合子）的生化参数进行比较，结果显示两组血清Lp（a）和Hcy水平差异有统计学意义，C等位基因携带者的血清Lp（a）和Hcy水平均明显高于非携带者（均P＜0.05），而年龄、收缩压、舒张压、BMI、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C两组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表8。

表7 3种r s2299661C/G不同基因型携带者临床资料的比较

表8 脑卒中组2种r s2299661C/G不同基因型携带者临床资料的比较

3 讨论

目前已知的脑卒中危险因素中高血压为脑卒中首要且独立的危险因素，且收缩压每增加10 mmHg，脑卒中发病相对危险增加49%；舒张压每增加5 mmHg，脑卒中危险增加46%[12]，提示两者可能拥有共同的遗传易感基因。我国高血压人群呈高Hcy水平状态，H型高血压约占我国成人高血压的80%[2-3]。研究显示中老年人血清Hcy水平与收缩压、舒张压或脉压相关。随着年龄的增长，脉压水平和主要终点心血管事件之间呈正相关[19]。Shi等[14]研究发现血清Hcy水平每升高5μmol/L，脑卒中风险将升高59%，缺血性心脏病的风险将增加32%，Hcy每降低3μmol/L，脑卒中风险将下降24%，缺血性心脏病的风险将会降低16%。本研究证实：高血压患者随着血清Hcy水平升高，脑卒中患病率呈增高趋势。有研究显示，在无脑卒中和心肌梗死的中国成人H型高血压人群中，降压和降低Hcy水平可显著降低首发脑卒中的风险，而对于低叶酸水平的高血压人群，补充叶酸可显著降低脑卒中发生的风险[15]。本研究亦显示H型高血压组随着患者血清Hcy水平升高，脑卒中患病率呈增高趋势，组间两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；Pearson相关分析结果显示，血清Hcy水平与脑卒中患病率呈正相关（r=0.171，P＜0.01），因此认为Hcy水平升高与脑卒中的发生存在着密切的联系[16]。

近年来有关脑卒中候选基因研究较多集中于与血压调节和高血压有关的基因。电压依赖性钙离子通道L-VDCC[Ca（V）1]为钙离子通道电压依赖性钙通道（voltage dependent Calcium channel，VDCC）的一种类型，为调控钙离子内流的离子通道，是目前已知选择性最强的离子通道[17]。研究认为L型钙离子通道及其相关的多种病理生理现象与高血压产生有密切联系[18]，而研究证实L型钙离子通道α1c亚单位是调节Ca2+进入细胞内的主要通道，因此对人类编码LTCCα1C亚基的基因CACNA1C研究[19]，对高血压及脑卒中的防治有着重要的理论和临床意义。CACNA1C基因位于染色体12p13.3，生成大约6.45 Mb的基因组区段，该基因由至少55个外显子组成[20]。本研究对CACNA1C基因选取5个SNP（rs216008、rs1051375、rs2299661、rs10848683、rs215976）位点进行测序，包括内含子的61765C/G（rs2299661）、外显子的558674 C/T（rs216008)、外显子的628667 C/G（rs10848683）、外显子的626417 A/G（rs1051375）、外显子的532175 C/T（rs215976），分析其对H型高血压和脑卒中的意义。研究结果显示H型高血压各组CACNA1C基因rs2299661位点基因型CC频率均高于对照组（均P＜0.05），脑卒中组与单纯高血压组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），但脑卒中组C等位基因频率高于非脑卒中组、单纯高血压组及对照组（均P＜0.05）。笔者推断：（1）脑卒中组与高血压组之间可能存在着共同的遗传易感基因；（2）CACNA1C的rs2299661C/G多态性与中国人群H型高血压脑卒中的发生有关联。分析推测这种作用机制为：（1）内含子的rs2299661在脑卒中组C/G可能产生基因变异，对钙通道蛋白mRNA剪接产生影响，进而出现原有的剪接位点消失，新的剪接位点生成；（2）编码钙通道氨基酸序列改变，这种改变可能引起钙离子通道蛋白相关元件的变化，引发钙离子通道通透性变化；（3）钙离子内流增加，肌细胞表面的动作电位改变，引起肌细胞的兴奋收缩藕联加强，外周血管阻力增加，出现脑血管的持续痉挛。另发现rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976 SNP位点在H型高血压组、单纯高血压组与对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），说明所选其他CACNA1C基因SNP位点与H型高血压或脑卒中间并无关联性。

本研究结果发现，高血压组CACNA1C基因的rs229966位点CG+CC基因型频率和C等位基因频率明显高于对照组，推测高血压患者G位点基因剪接为C位点基因，C等位基因增多，G→C替代后，合成表达Lp（a）与Hcy的转录因子活性增强，可能促使Lp（a）与Hcy血清水平表达增加，而两者水平的表达升高可造成动脉粥样硬化斑块的形成、迁移、崩解、破碎，引发脑卒中发生，进一步引起脑卒中后继发性脑损伤、神经元凋亡等[21]，参数比较结果也显示两组Lp（a）和Hcy水平差异有统计学意义，C等位基因携带者的Lp（a）和Hcy水平明显高于非携带者（P＜0.05），因此也证实高水平Lp（a）与Hcy与脑卒中发生呈正相关[22]，因此提示CACNA1C基因rs2299661位点C/G多态性可能与H型高血压脑卒中发生有关联，但Lp（a）与Hcy间如何相互作用，对H型高血压脑卒中的影响仍需继续研究。

综上所述，脑卒中是多基因、多因素疾病，是遗传和环境因素互相作用所致，本研究亦证实Hcy水平升高与脑卒中的发生存在着密切联系，CACNA1C基因rs2299661位点C/G多态性可能与H型高血压脑卒中发生有关联，C等位基因可能为H型高血压脑卒中的易感位点。