腹腔注射木犀草素调控sirt1/FOXO1通路对慢性坐骨神经结扎大鼠痛觉敏化的影响

华汤锋 金红芳 吕晨 郭小文

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由于外周或中枢神经系统直接损伤和功能紊乱所引起，并由伤害性感受通路活动异常导致的一种慢性疼痛，是临床亟待解决的常见病、难治病，而痛觉敏化是其特征性表现。既往研究提示，神经组织慢性炎症、神经元凋亡和表观遗传学改变，可能在其发病机制中起着重要作用[1-2]。木犀草素（3,4,5,7－四羟基黄酮）是一种天然黄酮类物质，存在于多种植物性食物和中草药中，有研究表明其具有抗氧化应激、抗炎、抗衰老和神经保护功能[3-4]。在对其抗伤害性感受作用的研究中发现，木犀草素可显著提高急性疼痛和化学刺激引发的痛阈水平，相关研究报道还证实其对慢性疼痛也有改善作用[5-7]。近年来有研究发现，沉默信息调节因子1（silent information regulator1，sirt1）具有调控机体细胞凋亡、炎性反应、氧化应激等作用，其与叉头转录因子1（forkhead box O1，FOXO1）组成的sirt1/FOXO1信号通路可抑制炎性反应和细胞凋亡，在神经、血管等组织退行性改变的病理过程中，起着重要的调控作用[8]，而黄酮类物质在多项研究中表现出潜在活化sirt1/FOXO1信号通路的作用[3，9]。基于此，本研究通过慢性坐骨神经结扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠痛觉敏化模型，探讨木犀草素调控sirt1/FOXO1通路对CCI大鼠慢性NP所致痛觉敏化的影响，为进一步临床应用提供实验依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠72只，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0016，体重240～260 g，喂饲普通饲料，自由饮水进食，自然节律采光。木犀草素粉剂（T1027）购自美国Target－Mol公司（纯度＞98%）；兔源GAPDH一抗（ab181602）、兔源sirt1一抗（ab189494）、兔源FOXO1一抗（ab39670）、羊抗兔二抗（ab150077）均购自美国Abcam公司，乙酰化FOXO1一抗（CST9441）购自美国Cell signaling technology公司；sirt1抑制剂EX527粉剂（S1541）购自美国Selleck公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8418）购自美国Sigma公司；图片灰度值分析及凝胶成像系统（GelDoc）为美国BioRad公司提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 按随机数字表法将大鼠分为4组：假手术组（S组）、坐骨神经结扎组（CCI组）、CCI联合木犀草素腹腔给药组（Lut组）、CCI联合木犀草素和EX527腹腔给药组（Lut+EX组），每组各18只。

1.2.2 CCI模型建立 CCI组、Lut组和Lut+EX组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉，消毒大鼠左下肢，切开左侧大腿中部暴露坐骨神经，在接近其分叉之前游离出约7 mm的神经，用4根320铬制羊肠线间隔1 mm进行松结扎，要求不阻断神经血供，然后逐层缝合切口。S组仅暴露坐骨神经并游离连接组织，但不做CCI。

1.2.3 腹腔给药 将木犀草素粉剂100 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化钠注射液2 ml中配制成50 mg/ml浓度混悬液备用，EX527粉剂20 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化钠注射液2 ml中配制成10 mg/ml浓度混悬液备用。模型建立后，S组和CCI组腹腔注射含1%DMSO的0.9%氯化钠注射液2.5 ml/kg；Lut组腹腔注射木犀草素混悬液（木犀草素剂量为100 mg/kg）2.0 ml/kg+含1%DMSO的0.9%氯化钠注射液0.5 ml/kg；Lut+EX组腹腔注射木犀草素混悬液（木犀草素剂量为100 mg/kg）2.0 ml/kg＋EX527混悬液（EX527剂量为5 mg/kg）0.5 ml/kg。各组大鼠均连续给药7 d。

1.3 疼痛敏化行为学检测 分别于CCI前1天及CCI后第1、3、7、14天检测各组大鼠机械性缩足反射阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）。

1.3.1 MWT检测 采用Von Frey细丝方法。机械测痛仪放置水平桌面，将大鼠放于仪器的有机玻璃箱中，待15min后适应环境。分别采用不同折力的Von Frey细丝刺激大鼠的足底部，观察缩足反应情况，当折力达到一定阈值时，足底移开Von Frey细丝而出现快速的缩足反应，将此折力记录为MWT，每次测量间隔2min，测量3次取平均值。

1.3.2 TWL检测 采用热辐射法。取辐射热痛觉测试仪的聚光光源照射大鼠足底部，观察和记录由照射到出现缩足的时间作为TWL，最大阈值为25 s，测量3次取平均值。

1.4 脊髓背角标本采集、保存、组织裂解 各组大鼠于CCI前1天和CCI后第7、14天行为学测定结束后，采用随机数字表法分别选取6只大鼠注射过量乌拉坦处死，分离左侧（CCI同侧）L4～5段脊髓组织，迅速置于液氮中保存。测定前加入蛋白裂解液充分裂解，用Bradford法测定蛋白质的浓度并调整为2μg/μl。

1.5 脊髓背角中sirt1、FOXO1、乙酰化FOXO1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。SDS-PAGE蛋白电泳，硝酸纤维素膜-电转移系统转印蛋白，TBS封闭后将硝酸纤维素膜与抗单克隆一抗（1∶1 000），辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（1∶6 000，Abcam）进行免疫印迹反应。以GAPDH（1∶1 000）为参照，加入的底物DAB H2O2溶液显色。采用BioRad图像分析系统进行图像处理和蛋白表达水平测定。

2 结果

2.1 各组大鼠MWT的比较 CCI前1天各组大鼠MWT相近（P＞0.05）；CCI后第1、3、7、14天，CCI组、Lut组、Lut+EX组MWT均低于S组（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut组MWT明显高于CCI组（均P＜0.05），而Lut+EX组与CCI组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠M W T的比较（s）

2.2 各组大鼠TWL的比较 CCI前1天各组大鼠TWL相近（P＞0.05）；CCI后第1、3天，CCI组、Lut组、Lut+EX组TWL均低于S组（均P＜0.05），第7、14天时Lut组与S组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），而另两组明显低于S组（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut组TWL均明显高于CCI组（均P＜0.05），而Lut+EX组与CCI组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠T WL的比较（s）

2.3 各组大鼠脊髓背角sirt1、FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平的比较 与S组比较，各组大鼠CCI后第7、14天脊髓背角sirt1蛋白水平均下降（均P＜0.05），Lut组和Lut+EX组sirt1蛋白水平较CCI组均明显增高（均P＜0.05）。与S组相比，各组大鼠在CCI后第7、14天脊髓背角FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平均上调（均P＜0.05）；与CCI组和Lut+EX组比较，Lut组在CCI后第7天FOXO1蛋白水平升高，第14天FOXO1蛋白水平降低，乙酰化FOXO1水平较前两组降低更明显（均P＜0.05）。见表3、4和图1。

图1 各组大鼠脊髓背角FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白表达电泳图[沉默信息调节因子1（sirt1），叉头转录因子1（FOXO1），坐骨神经结扎（CCI）]

表3 各组大鼠脊髓sirt1蛋白水平的比较（sirt1/GAPDH灰度值）

3 讨论

NP是一种复杂的慢性疼痛，流行病学研究显示，人群总体患病率高达3.0%～8.0%[1，10]，据此推算，我国有7 000万左右患者，导致患者生活质量下降，医疗资源负担增加。因其发病机制目前尚未完全阐明，故其治疗效果和预后仍亟待提高。

CCI大鼠模型是一种经典的慢性疼痛模型，其主要机制为外周损伤和严重炎症反应诱发的神经病理性改变，可表现出自发痛、触诱发痛和痛觉过敏等，与临床病理性疼痛特征十分相似。本研究参照Bennett等[11]方法建立CCI模型，因为此种方法非常类似临床脊神经根卡压炎症引发的NP，且操作创伤较小，不给予其它神经毒性药物，因此建模过程中，实验大鼠均存活至研究结束。CCI大鼠建模后第1～14天，MWT和TWL均明显低于S组，同时说明CCI模型构建成功。

木犀草素作为一种天然黄酮类物质，存在于多种蔬菜、水果和药用植物中，并且具有各种药理活性。而具有镇痛药效的中草药如川穹、紫菀等均含有此类黄酮物质[3-4]。在多项动物研究中证实，木犀草素可以改善NP。不同的给药方式（椎管内和颅内给药）呈现不同的下游受体活化，包括GABA受体、阿片μ受体等，而且提示木犀草素抗伤害性疼痛和抗炎效能均很高，且呈剂量相关性[12]。本研究采用腹腔注射给药，其优点是腹膜面积大、血管和淋巴管分布丰富，吸收能力强；另一方面，木犀草素水溶性低，溶媒采用1%DMSO，而腹腔给药，可降低其毒性反应。本研究结果同样显示，Lut组大鼠CCI后各个时点的MWT和TWL均显著高于CCI组大鼠，而在CCI后第14天，MWT和TWL已接近S组。

行为学多项研究已证实木犀草素可有效改善NP程度，但对其机制的研究，则多集中在抗氧化和抗炎反应的下游蛋白和分子，如NF-κB、IL-1β、基质金属蛋白酶（MMD-9）、趋化因子（CXCL2、CXCL9）等[13-14]，而对调节蛋白质表达的信号通路和表观遗传学调控，如乙酰化、泛素化的上游分子机制的研究尚不足。FOXO1是O-box子家族中叉头转录因子的成员，其余还包括FOXO3、O4、O6等，它在炎症、代谢、肿瘤、缺血再灌注等多种生理病理调解中，起着重要作用[8，15]。Oscar等[16]在对高龄小鼠椎间盘退行性变引发的后背痛的研究中发现，随着年龄增加FOXO1表达下降，其下游靶点sestrin 3（SESN3）和超氧化物歧化酶表达水平也随之降低。Chen等[17]采用生物信息学和微阵列芯片技术对神经痛大鼠的脊髓背角进行研究，发现FOXO家族基因的mRNA表达增加在整个调控网中承担关键的角色。本研究发现CCI后，脊髓背角FOXO1蛋白表达显著增高，尤其乙酰化FOXO1表达上调更为明显，这必然诱导其下游参与氧化应激和炎症反应的蛋白和介质上调，而Lut组乙酰化FOXO1上调程度显著降低，提示木犀草素可调控FOXO1的表达和乙酰化水平。

表4 各组大鼠脊髓FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平的比较

FOXO1活性受乙酰化、磷酸化和泛素化调节，其中sirt1介导FOXO1脱乙酰化作用后，FOXO1由细胞核向细胞质转移，并降低其生物学活性[18]。而大鼠sirt1基因启动子区域含有一个拟叉头样（forkhead-like，FKHD-L）结合位点，它与FKHD共有元件（TTGTTTAC）在8个碱基中的5个基序上反向排列，并且一组5个胰岛素响应性核心重复基序，FOXO1通过与这些结合元件的结合直接激活sirt1转录，从而形成sirt1的自反馈通路[19]。sirt1/FOXO1信号通路是能量代谢和基因组稳定的关键调节通路。本研究提示，在CCI组中，可以观察到术后各时点脊髓背角组织中sirt1表达均下调，而乙酰化FOXO1的表达反向增高；而在Lut组中sirt1表达下调较少，同样乙酰化FOXO1表达反向上调亦不显。在EX527特异性拮抗sirt1效应后，FOXO1和乙酰化FOXO1表达再次出现显著增加。由此证实，木犀草素可以部分逆转CCI导致的脊髓背角sirt1和FOXO1表达和乙酰化程度，进而调控sirt1/FOXO1信号通路。

综上所述，腹腔注射木犀草素能抑制CCI大鼠的机械痛敏和热痛敏，通过增加脊髓sirt1表达并抑制FOXO1的乙酰化水平，调控sirt1/FOXO1信号通路，进而抑制下游炎症、疼痛相关的基因表达，最终改善CCI大鼠的痛觉敏化。但木犀草素的药理作用尚未完全清楚，在NP中的作用可能存在更为广泛的分子靶点，长期使用是否存在神经系统的严重并发症，这些仍需进一步的研究探讨。