基于唾液转录组学探讨慢性胃炎和胃癌脾虚证的分子机制

雷慧珺 曹建中 李亮 谢梦洲 付越 李丰

摘要 中医证候研究是中医药学的研究热点，基于唾液转录组学探讨疾病证候的复杂性并揭示其科学内涵具有巨大科研潜力。现分析了慢性胃炎和胃癌脾虚证的联系以及疾病的进展过程。基于唾液外泌体exoRNA表达谱，运用唾液转录组学的学科优势，在中医学同病异证，异病同证的理论指导下，提出寻找其具有临床价值的差异表达的分子标志物。进一步推动证候物质基础的定量、定性研究，并从分子机制角度切入促进中医肿瘤证候的精准化发展。

关键词 唾液转录组学;唾液外泌体;中医证候;同病异证;异病同证;差异分子标志物;精准化

Abstract The research of traditional Chinese medicine （TCM） syndrome is the key problem of TCM research，and it is of great research potential to explore the complexity of disease syndrome and reveal its scientific connotation based on saliva transcriptomics.This paper analyzes the link between chronic gastritis and gastric cancer spleen deficiency syndrome and the progression of the disease.Based on the exoRNA expression profile of salivary exosomes，using the academic advantages of salivary transcriptomics，and the guidance of the theory of Chinese medicine same disease with different syndrome and different disease with the same syndrome，we propose to find molecular markers with different expression of clinical value.We further promote the quantitative and qualitative research on the material basis of syndrome，and promote the precise development of the tumor certificate of Chinese medicine from the perspective of molecular mechanism.

Keywords Saliva Transcriptomics; Saliva Exosome; Traditional Chinese medicine syndrome; Same disease with different syndrome; Different disease with the same syndrome; Differential molecular markers; Precision

中圖分类号：：R241;R573文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.024

人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）全基因组测序的完成，标志着人类进入了后基因组学时代，新的以“组学”为研究标志的转录组学，蛋白质组学，代谢组学等系统生物学在生命科学中得到了广泛应用。证的研究是对疾病发生发展过程中某一特定阶段疾病本质的观察，是对致病因素与机体的反应两方面具体情况的有机综合，是正邪抗争态势情况的反映。相关研究表明，中医的证可以和临床生化指标相同，作为疾病的一类临床表征，中医的证是有物质基础的[1]。证可以通过基因水平上的生物标志物来量化和表征。唾液转录组学的系统性、动态性、复杂性与中医学的整体观念、病证结合模式、辨证论治理论有极大相似性，在揭示中医疾病的证候本质方面具有巨大潜力。基于唾液外泌体exoRNA表达谱，寻找不同病证的差异表达的分子标志物，有助于进一步推动中医证候的客观化研究。

1 慢性胃炎与胃癌的演变进展

慢性胃炎是指多种因素引起的胃黏膜的慢性炎症或萎缩性病变[2-3]，是临床常见的慢性消化系统疾病之一。流行病学研究表明，健康人群慢性胃炎发病率超过一半，小部分患者最终甚至发展成为胃癌[2]。目前国际上公认的肠型胃癌的发生模式为Correa模式[4]，其发生发展可能经过如下几个过程：1）正常人（N）;2）慢性浅表性胃炎（CSG）;3）慢性萎缩性胃炎（CAG）;4）CAG伴肠化（Intestinal Metaplusi）和（或）不典型增生（Dysplasia）;5）GC[3]。

胃癌是临床上常见的起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤之一，不仅起病隐匿，而且进展迅速且存在高转移和高复发的风险，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位[1-2，4]。在早期胃癌筛查过程中，由于患者缺乏特异性的具体临床表现，医者通常不能通过症状、体征进行临床确诊，所以传统上使用影像学检查和临床生化、病理检查进行诊断，但效果并不理想。寻找一种预防疾病传变，提高患者5年生存率的早期诊断和治疗方法是十分必要的。

2 慢性胃炎和胃癌脾虚证的病因病机及其历史沿革

在中医古籍里，有类似“胃癌”这一病名记载，其可归属于“胃反”“反胃”“积聚”“噎膈”“伏梁”“胃脘痛”等的范畴[5]。《太平圣惠方·第四十七卷》指出：“夫反胃者，为食物呕吐，胃不受食，言胃口翻也。”《金匮要略·呕吐哕下利脉证治》曰：“趺阳脉浮而涩，浮则为虚，涩则伤脾，脾伤则不磨，朝食暮吐，暮食朝吐，宿谷不化，名曰胃反。”《灵枢·邪气脏腑病形》指出：“胃病者，腹月真胀，胃脘当心而痛。上支两胁，膈咽不通，食饮不下。”胃癌的病因较为广泛和复杂，主要有外邪犯胃、情志失调、脾胃素虚，热毒血瘀、痰瘀壅塞等方面[6]。胃癌的形成是一个本虚标实、虚实夹杂日久积聚成块的过程[7]。气滞血瘀、肝气犯胃、痰湿中阻、胃热伤阴等实证以及脾胃虚寒、胃阴不足、气血两虚等虚证为胃癌的常见中医证型[8]，胃癌的中医证型也因治疗方式的干预存在着一些动态变化[9]。

陶丽和杨金坤[10]对1 266例胃癌患者临床分型研究结果显示脾虚型排在第一位。许玲等[11]对767例胃癌患者中医辨证分型的临床分析，结果提示脾胃虚寒在证型比例中占32.9%排在首位。黄美琴等[12]对154例胃癌患者进行证型频次分析，结果显示进展期胃癌脾胃虚损频次在气血亏虚、气滞血瘀、胃热阴虚、痰湿凝结、肝胃不和5种证型中最高。脾胃虚弱，受纳失司，升降失调，运化水湿功能失调，湿痰饮停滞交阻易结聚成肿块。根据中医古籍和古近代医家的描述，就胃癌而言，其疾病的发生发展过程当中，脾胃亏损是所有病机共同拥有的主线[13]。

中医学认为，慢性胃炎可归属于“胃痞”“胃脘痛”“痞满”“嘈杂”等范畴[14-15]。《素问·至真要大论》谓“太阳之复，厥气上行……心胃生寒，胸膈不利，心痛痞满”;《素问·太阴阳明论》说：“饮食不节，起居不时者，阴受之，阴受之则入五脏，入五脏则月真满闭塞。”《素问·评热病论》指出“邪之所凑，其气必虚”，正气亏虚是慢性胃炎的发病关键。脾胃气虚型是慢性胃炎临床出现频次最高的中医证型[16]。脾胃共有“后天之本”之称，脾升胃降，是人体气机升降的枢纽。五脏六腑、四肢百骸皆赖脾胃运化水谷以充养，为人体正气之大源。脾胃健旺，正气抗邪外出;脾胃虚弱，正虚邪侵发病。因此，脾胃虚弱是胃癌发生、发展的基础，存在于整个癌前、癌变过程中，是胃癌病机的关键所在。

3 唾液活检，是证候研究的一个新的方向，是一种有前景的临床检测手段

在诸多可用于医学诊断的体液，唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺、无数小唾液腺分泌的黏液及龈沟液等组成，其组成与血清相似，包括各种核酸、蛋白质及各种小分子。作为人体体液的一部分，其成分水平受机体各种病理生理变化的影响。对于广泛用于医学诊断的血液来说，血液样本的分析过程烦琐、费用昂贵，且存在侵入性问题。如HBV、HCV、DNAs和抗体以及病毒抗原不仅存在于感染患者的唾液中，也与血液样本有关，但血清学指标检测存在着一定的感染风险[17]。相比于唯一与所有器官都有接触的血液来说，唾液有许多优点：1）收集要求不高;2）非侵入性操作;3）样品处理无感染性风险;4）样品储藏方便;5）操作经济节约[18]。

随着生物化学微量分析技术的发展，唾液代替血液作为诊断指标开始崭露头角[17]。作为一种无创的口腔和全身性疾病诊断指示物中很丰富的生物液体，它在早期检测中具有独特优势[19]。

唾液被认为与中医学概念的脾脏关系最直接、最密切。在中医五脏化液理论中被这样描述，“脾在液为涎，肾在液为唾”“脾气通于口”“口为脾之官”，故可认为脾直接且主要影响唾液的分泌。此外，脾胃通过经脉相互络属而构成表里相合关系，脾与胃纳运相成，升降相因，燥湿相济，共同完成水谷精微的受纳、转运。因此，唾液可以反映脾胃功能是否正常，从而客观地反映个体当前的健康状况，其中包含的分子信息可以在微观层面上反映疾病的证候变化。唾液活检本身具有血清学和其他检测所不能达到的优势，并且有中医古籍诊断理论的支持，正成为当前无创检验领域最具潜力和应用前景的研究热点，也是中医学证候研究的创新方向。

4 唾液外泌体exoRNA的新兴以及唾液转录组学在证候研究中的潜力

作为新兴的研究热点“外泌体”这一名词是Trams等[19]在1981年在研究细胞核酸外切酶活性时发现并首次提出的;Johnstone等[20]后又补充发现外泌体是细胞分泌的一种由脂质双层膜包裹的直径为30～100 nm大小不一的纳米级细胞外囊状小体，几乎所有的真核细胞均分泌这种磷脂双分子膜结构的细胞囊泡[21]。

外泌体是由多种细胞经过“内陷-聚集-分选-融合-外排”等一系列过程分泌的[22-23]。从细胞膜内陷形成早期核内体开始，mRNA和蛋白质分子等开始聚集在早期核内体中，后成为晚期核内体并且在转运所需的内吞体分选转运复合物及其他相关蛋白质的协同作用下形成多泡体。多泡体与细胞膜融合后，细胞内物质以囊泡形式即外泌体释放到细胞外[24-25]。

作为液体活检“三驾马车”（外泌体，循环肿瘤细胞，游离DNA）之一，外泌体携带有亲本细胞来源相关的多种蛋白质、脂类和核酸等生物信息分子，在细胞间通信、细胞迁移、细胞分化、免疫调节等信息交流、物质交换过程中扮演着不可或缺的角色[26]。其相关物质可通过直接的膜融合作用、内吞作用和配体/受体的相互作用转移到靶细胞，从而发挥相应的生物学功能[27]。外泌体中蛋白质、核酸（mRNA、microRNA、DNA等）、脂类等内容物可以近似真实地反映其源细胞的特征和状态[28-29]。外泌体丰富的内含物极其广泛的存在，使外泌体检测成为一种非常有潜力的无创诊断方法。新近的研究证明唾液的基因转录组因其不易降解，具有更好的稳定性，包含更多的信息[30]。加州大学洛杉矶分校（UCLA）David Wong实验室（2004）首次报道了唾液中的细胞exoRNA被用于检测口腔癌[31]，随后发现唾液RNA分子可用于乳腺癌[32]、胰腺癌等癌症的早期诊断[33]。由于唾液中含有大量RNase，唾液中的exRNA期初并没有受到重视，最近的研究发现，唾液中的exRNA大多存在于外泌体中并受到保护。加入表面活性剂后RNA会迅速的分解[34]。研究还发现唾液中大量的miRNA，piRNA都主要存在于唾液外泌体内[35]，这为进一步研究唾液外泌体在全身性疾病尤其是肿瘤领域奠定了基础。

基于体积小有保护膜这一特点，肿瘤外泌体在肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与周围细胞之间的信息交流、物质交换过程中扮演着重要的信使角色与远端的受体细胞融合，传递蛋白质、miRNA和免疫抑制分子）。肿瘤外泌体既可诱导血管生成（有助于建立肿瘤微环境），形成预转移龛;又可诱导凋亡细胞毒性T细胞引起免疫逃逸，促进肿瘤的生长和侵袭转移[36-37]。并且相比于正常细胞，肿瘤细胞可释放更多且内容物差异明显的外泌体。在液体活检研究领域中，研究发现以外泌体方式分泌的胃癌细胞高表达CD97可调节肿瘤细胞的MAPK信号通路，促进肿瘤细胞的生长和浸润[38]。胃癌细胞能通过外泌体选择性地将let-7释放出细胞，导致胃癌发生恶性病变[39]。通过检测肿瘤细胞外泌体中含有的蛋白质和核酸分子或许可以提高肿瘤诊断的特异性和灵敏度。体液中的肿瘤外泌体可视为“液体活检”的重要組成成分[29]，作为生物标志物在消化肿瘤的各项研究中显示出积极的意义。肿瘤外泌体或许成为一种有潜在价值的胃癌诊疗标志物。

5 展望

随着转录组学技术、深度测序技术等现代分子生物学技术的发展，唾液近十年来在疾病诊断方面取得了很大发展，但与中医证候研究相结合还处于早期探索阶段。完善唾液分子检测数据库，建立系统的唾液转录组学知识格，规范证候诊断标准，充分发挥我国巨大的患者资源优势非常重要。从临床研究和动物实验两方面入手，扩大研究样本量，可以使数据更具重复性和说服力。基于课题组之前的研究，提出了具体的研究途径：1）构建同病异证、异病同证的动物模型和收集同病异证、异病同证的临床患者，并提取样本作为研究对象;2）对每种疾病进行唾液转录组学分析，找到差异表达的exoRNA生物标志物，并进行回复验证[40];3）获得具有临床意义的疾病证候的生物标志物。希望最后的结果可以推动基础研究技术向临床椅旁检测技术发展，使中医证候研究朝着更加规范、标准、客观的方向发展，推动建立精准的中医诊治模式。

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（2020-11-17收稿 责任编辑：张雄杰）