自噬在脂多糖引发的心肌损伤中的作用机制及中医药研究

江艳艳 王晓平 李伟利 田雪 姜茜茜 孙乾斌 张倩 马林 王伟 李春 王勇

摘要 脓毒症引发的心肌损伤是重症监护病房脓毒症患者死亡的主要原因之一。通过研究脂多糖（LPS）诱导的脓毒症致心肌损伤模型，探讨保护心肌损伤的治疗方法与策略，能为临床治疗脓毒症引起的心肌损伤提供实验依据。自噬通常被认为是降解多余、受损的细胞成分实现物质循环再利用的调节机制，在保护心肌细胞结构和功能方面发挥重要的调控作用。最新研究发现自噬失衡是引发心脏毒性损伤的关键机制，而通過自噬调节可以改善LPS引发的心肌损伤。现系统梳理自噬信号通路在LPS引发的心肌损伤中的作用机制及中医药治疗的研究进展，为脓毒症引起的心肌损伤的治疗提供新的思路和方法。

关键词 自噬;自噬通量;脂多糖;脓毒症;心肌损伤;中药复方;双荧光标记;中医药

Abstract Myocardial injury caused by sepsis is one of the leading causes of death in patients with sepsis in intensive care units.Studying the model of myocardial injury induced by Lipopolysaccharide（LPS）and exploring the therapeutic methods and strategies for myocardial injury can provide experiment basis for clinical treatment of myocardial injury induced by sepsis.Autophagy is generally considered to be a regulatory mechanism that degrades excess and damaged cell components to realize material recycling and reuse，and plays an important regulatory role in protecting the structure and function of cardiomyocytes.The latest research has found that autophagy imbalance is the key mechanism leading to cardiotoxic damage.The regulation of autophagy can improve myocardial damage caused by LPS.This paper aims to systematically sort out the mechanism of autophagy signaling pathway in myocardial injury caused by LPS and the research progress of traditional Chinese medicine treatment，and provide new ideas and methods for the treatment of myocardial injury caused by sepsis.

Keywords Autophagy; Autophagy flux; Lipopolysaccharide; Sepsis; Myocardial Injury; Chinese medicine compound; Double fluorescent labeling; Traditional Chinese medicine

中图分类号：R228文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.025

脓毒症是由细菌、真菌或病毒引起的感染性疾病，严重时会导致器官功能障碍[1]，其中以心脏功能障碍最为多见，但其机制尚未完全阐明[2]。大量实验研究采用腹腔注射脂多糖（LPS）建立脓毒型心肌损伤模型，进而模拟临床脓毒症情况下心肌损伤的病理特征并研究其具体机制。LPS是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，由3个通过共价键连接的结构域组成，包括脂A的糖脂部分、糖链以及核心低聚糖[3]。其中脂A被称为内毒素，是LPS的毒性成分，可以显著促进炎症和免疫应答反应。作为目前研究最多的细菌免疫刺激成分之一，LPS很难从细胞壁脱落，当细菌死亡时它会通过溶解、破坏细胞来脱落[4]。研究表明当LPS进入机体后，游离的LPS可以与免疫细胞相互作用，并诱导炎症介质、促凋亡因子和促纤维化因子等的释放，导致心脏冠状动脉血流减少，心律失常，心脏前负荷、后负荷改变等变化，直接损伤心肌细胞，影响心功能[5]，造成心肌纤维化和心肌梗死等心脏疾病[6-7]。尽管现代医学在危重症的分子生物学方面已经取得了重大进展，但心功能障碍依旧是脓毒症患者死亡的主要原因之一[8]。最新研究表明，LPS刺激会导致机体内细胞自噬水平的变化，其中心脏自噬的改变尤为显著。自噬作为细胞在应激状态下将自身受损或衰老的细胞器和错误折叠的蛋白降解以维持自身能量需求的一种适应性反应，在其失调时同样会对细胞产生有害作用[9]。因此深入探讨自噬在LPS诱导的心脏损伤中的作用机制以及基于自噬调控的治疗方法具有重要的临床意义。

1 自噬的分类

在哺乳动物细胞中，自噬有2种不同的分类方法：1）根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同分为3种主要类型：大自噬，微自噬和伴侣介导的自噬[10]。2）根据自噬对降解底物的选择性分为两类：选择性自噬和非选择性自噬[10]。尽管每种自噬在形态上不同，但最终都会将底物运送至溶酶体进行降解和再循环。大自噬依赖于自噬体的形成，包裹底物运送至溶酶体;微自噬是通过溶酶体膜的内陷直接吸收底物;分子伴侣介导的自噬直接将未折叠的蛋白质转运通过溶酶体膜[11]。现代研究目前主要集中在大自噬（下文所指自噬），具体过程分以下几个阶段进行：包括分隔膜的初步形成及延展、吞噬小泡的形成、自噬体成熟和底物隔离、自噬体-溶酶体膜融合以及自噬溶酶体的内容物被溶酶体内水解酶降解，最终自噬溶酶体的降解物被释放以进行物质循环[12]。线粒体自噬（Mitophagy）是选择性自噬的一种，其对受损或衰老线粒体的选择性降解在维持能量稳态和减少由功能障碍线粒体产生的活性氧和线粒体DNA方面起着重要作用[13]。线粒体作为细胞中的能量供应器对心肌细胞至关重要。一些研究发现LPS会损害心肌细胞线粒体，通过调节线粒体自噬水平能减缓LPS诱导的心肌损伤[14-15]。然而自噬在LPS诱导的心肌病中的具体机制还需进一步研究。

2 自噬的过程及调节因子

自噬的诱因复杂，主要分为胞内和胞外，胞内信号来源于损伤、衰老的细胞器及长寿命蛋白等，胞外信号包括缺氧、饥饿、生长因子（如胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板来源增殖因子以及生长激素释放抑制因子等）等[12]。自噬的调节因子也十分多样，在特定条件下，自噬对调节因子传导的环境信号做出反应[16]。1）饥饿是一种有效的自噬生理调节因子，可以通过哺乳动物雷帕霉素靶点蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）调控自噬，mTOR主要包括大分子复合物mTORC1[17]。2）另外生长因子刺激Ⅰ类磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB）途径或其他营养相关信号（如亮氨酸），激活mTORC1负调控UNC-51激酶1复合物（ULK1、ATG13、ATG101和FIP200）;相反，能量耗竭则抑制mTORC1，允许激活ULK1介导的自噬关键起始步骤[18]。程序性死亡受体-1（Beclin1）与膜泡分拣蛋白34（Vacuolar Protein Sorting 34，VPS34）及VPS15形成复合物启动自噬体的形成[19];随后其他自噬相关蛋白（Autophagy Related Proteins，ATG）被募集以促进膜的延伸，许多ATG蛋白在酵母和哺乳动物之间是保守的，并参与泛素样结合系统（该系统包括泛素激酶E1的Atg7，2个泛素结合酶E2的Atg10和Atg3，以及2个泛素类蛋白Atg8和Atg12，对自噬泡的成熟和包裹物的招募具有重要作用）形成自噬体，自噬体延伸需要2个泛素样结合系统：ATG5-ATG12结合系统和微管结合蛋白轻链3（Microtubule-associated Protein 1A/1B-light Chain 3-ATG8）结合系统;当膜结构进一步延展时，自噬体与底物上的受体或衔接蛋白结合，以促进底物进入自噬体;随后包裹底物的自噬体在相关分子Rab（Rab5、Rab7）、UVRAG、SNARE等的作用下与溶酶体融合，在溶酶体水解酶作用下降解底物实现物质再循环。溶酶体的生物活性和功能取决于溶酶体内环境酸碱度、溶酶体水解酶活性及溶酶体相关蛋白LAMP1、LAMP2的调节[20]。

3 自噬信号通路

自噬信号通路有很多报道，目前对自噬信号通路的研究主要集中在：1）mTOR信号通路;2）腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）信号通路;3）Beclin1-Bcl-2（Bcl2，B细胞淋巴瘤-2，抑制凋亡的线粒体内膜蛋白）信号通路;4）转录因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）信号通路。

3.1 mTOR信号通路 作为自噬负性调控因子中研究的热点，mTOR是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能与多种结合蛋白相互作用，其中研究較多的mTORC1由mTOR、RAPTOR、PRAS40、DEPTOR、MLST8等组成[21]。mTORC1调控自噬的机制包括：1）直接磷酸化ULK1的Ser757位点进而抑制ULK1的活性，抑制自噬体的形成[11];2）磷酸化AMBRA1（自噬/Beclin1调控因子）进而抑制ULK1稳定性，抑制自噬体的形成[22];3）磷酸化PI3K复合物中的Atg14进而抑制自噬体的形成[23];4）抑制TFEB的核定位进而抑制溶酶体相关基因的转录，抑制自噬溶酶体的形成及降解[24]。mTORC1的上游信号包括：1）胰岛素或生长因子信号主要通过PI3K-AKT-TSC复合物-RHEB激活mTORC1[23];2）活化的AKT直接磷酸化抑制PRAS40（mTORC1的抑制蛋白激酶），从而激活mTORC1抑制自噬[25]。在LPS诱导的心肌损伤中，通过激活mTOR通路，调节自噬可以保护心肌细胞。如Han等[26]研究发现阿托伐他汀（Atorvastatin）通过抑制mTOR上游蛋白AKT，mTOR和mTOR下游核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）的磷酸化促进自噬，改善LPS诱导的炎症反应，保护心脏。Zhou等[27]发现在LPS诱导的肠道上皮炎症模型中，通过抑制mTOR的活性激活Atg5促进自噬小体的形成，会减轻LPS诱导的肠道上皮细胞炎症反应。

3.2 AMPK信号通路 AMPK是一个高度保守的激酶，通过协调多种代谢通路来维持全身能量代谢的稳态[28]。以α，β，和γ异源三聚体的形式存在于多种组织中，其亚基的多个位点可通过被磷酸化和去磷酸化而发挥自噬调节作用[29]。AMPK调控自噬的机制包括：1）磷酸化TSC2和RAPTOR抑制mTORC1，从而促进自噬[30-31];2）直接磷酸化UKL1的Ser555和Ser317位点，激活ULK1，进而启动自噬体的形成;3）激活FOXO3，TFEB和BRD4等转录因子的表达间接促进自噬[32];4）调节细胞周期负性调控因子p27Kip1的磷酸化而促进自噬[33]。AMPK的上游信号包括：1）缺氧时，细胞内AMP或ADP水平升高，AMP或ADP可以与AMPK的γ亚基结合激活AMPK[34];2）肝激酶B1（Liver Kinase B1，LKB1），钙调蛋白依赖性蛋白激酶酶β（CaMKKβ）以及转化生长因子激活酶（TGFβ-activated Kinase，TbAK1）也可激活AMPK[35-37]。研究发现通过AMPK通路调节心肌自噬水平可以对抗LPS诱导的心肌损伤。如Zhang等[38]发现LPS可以明显促进心肌细胞中AMPK上游调节因子蛋白磷酸酶2（PP2A）和蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达抑制AMPK，激活mTOR，从而改变心肌细胞自噬水平。

3.3 Beclin1-Bcl-2信号通路 Beclin 1是酵母自噬相关蛋白Atg6与Vps30在哺乳动物中的同源物，与PI3K-Ⅲ相互作用产生磷脂酰肌醇3-磷酸（Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），PI3P是自噬小体形成所必需的效应蛋白[39]。抗凋亡蛋白Bcl-2能与Beclin1相互作用，调节细胞内的自噬水平[40]。Beclin1-Bcl-2调节自噬的机制为：正常情况下，Beclin1与液泡蛋白分选蛋白（Vacuolar Protein Sorting，Vps34），p150，Atg14三者结合形成复合物，Bcl-2通过BH3结构域与Beclin1相互作用，抑制Beclin1活性，从而抑制Beclin1介导的自噬;在缺氧或饥饿等应激条件下，Bcl-2会与Beclin1复合物解离，诱导Beclin1引起的自噬[41]。研究发现在受到外界刺激时，负调控自噬活性的Bcl-2家族蛋白（Bcl-2/XL）可以被各种激酶（包括DAPK、ROCK1、Mst1和JNK1）调控，促进其与Beclin1的解离诱导自噬[42]。Sun等[43]的研究发现在LPS诱导的心肌损伤模型中，通过调节Beclin 1的表达改善细胞自噬水平会减轻LPS诱导的心肌损伤。

3.4 转录因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）信号通路 TFEB是自噬的主要转录调控因子之一，它促进自噬体形成、溶酶体生物发生，是溶酶体功能的关键调控因子[44]。在饥饿或溶酶体功能障碍的情况下，TFEB被磷酸化，进而迅速转移到细胞核并激活其靶基因的转录[45]。TFEB调控自噬的机制包括：1）直接与协调溶酶体表达和调控的基序结合，促进包含其启动子调控基序的整个基因网络的表达，增加溶酶体数量和溶酶体酶的释放[46-47];2）与众多自噬基因的启动子区域结合，并诱导自噬体生物发生和自噬体溶酶体融合;3）TFEB过表达还可以导致大体积自噬底物（如长寿蛋白）的降解增强、脂滴清除和线粒体损伤;4）参与调节特异性细胞器自噬，如脂噬和线粒体自噬[45]。许多研究发现通过调控TFEB的磷酸化水平来控制细胞自噬水平，对疾病的发生发展有良好的调节作用。如Kim等[48]研究发现通过CO激活蛋白激酶R（PKR）样内质网激酶（PERK）和Ca2+水平和钙调磷酸酶活性，增加了TFEB的核转运，提高了鼠肝细胞和肝组织中线粒体自噬的水平和溶酶体基因Lamp1、CathB、TPP1等的表达。

虽然LPS调节自噬的机制尚未完全阐明，但许多研究证实传统中药通过多途径调节心肌细胞mTOR、AMPK以及自噬体形成关键蛋白的水平，有望保护心肌细胞对抗LPS诱导的心肌损伤[38，49]。

4 自噬与LPS诱导心肌损伤的关系

LPS引起的脓毒症造成的急性休克和心肌损伤，一直是临床医生和科学家高度关注的问题，然而其致病机制尚未明确。许多研究已经探讨了LPS诱导的心肌损伤的分子机制，先前的研究表明炎症反应，微循环受损和细胞病变性缺氧是LPS诱导心脏损伤的重要病因[50-51]。而随着自噬在应激状态下维持细胞内环境稳态和保护心肌细胞的作用被重视，自噬调控逐渐成为了治疗脓毒症中心肌损伤的关键机制[17，52]。

最近的研究发现LPS刺激产生的过量炎症介质会引起小鼠心肌自噬水平发生显著变化[53]。然而不同研究者对小鼠心肌自噬水平的变化有不同的观点：一些研究者认为自噬是细胞在应激状态下的适应性反应，通过提高心肌细胞自噬通量可以对抗LPS诱导的心肌损伤，如Pan等[54]研究发现褪黑素可以调节线粒体解偶联蛋白（UCP），提高LPS诱导的心肌细胞自噬水平，保护线粒体的结构和功能，缓解LPS诱导的心肌损伤;Unuma等[55]发现钴原卟啉可以激活心肌细胞TFEB和LAMP蛋白促进自噬体形成，保护心肌细胞，缓解LPS诱导的心肌损伤。也有研究者认为LPS诱导的心肌细胞自噬是过度自噬会损害心肌细胞，如Li等[56]认为LPS诱导的心肌细胞自噬是过量的，他们发现一种重要的生物活性肽阿拉曼定（Alamandine）可以在一定程度上抑制LPS处理小鼠心脏中Atg3和Atg5 mRNA水平的升高，减少LPS诱导的微管结合蛋白轻链3（Microtubule-associated Protein 1A/1B-light Chain 3，MAP-LC3）的增加，降低LPS处理鼠的自噬水平的强烈增加，减弱LPS对小鼠心脏结构和功能的破坏。LPS刺激剂量、刺激方式及刺激时间以及判断自噬水平的监测方法的差异，均会导致自噬调控结果在同一脓毒症模型中的表现不一致。尤其是针对自噬水平的判断，多数研究集中于自噬相关蛋白表达量的研究，而自噬是一个动态且复杂的过程，需要对其整体通量进行综合评估。如在研究自噬水平时，通过自噬指示蛋白的表达量来反映细胞的自噬水平是片面的，应在自噬指示蛋白表达水平研究的基础上，进一步综合采用GFP-mRFP-LC3双荧光标记、电镜等方法，对自噬通量即包括自噬体、自噬溶酶体以及溶酶体活性等多个环节与角度进行综合评估进而判断自噬通量[57]。同时，研究自噬通量的时间点也因研究目的不同而异。因此，应建立LPS刺激的剂量梯度和时间梯度，以检测并绘制心肌细胞在体自噬水平变化。综合以上的研究将为通过干预自噬治疗LPS引起的心肌损伤的最佳给药时间及给药剂量提供指导。

5 中药在LPS引发心肌损伤中的研究进展

根据《国际脓毒症和感染性休克管理指南》2016版[58]，针对LPS引发的心肌损伤强烈建议尽快开始抗菌治疗，这是由于在治疗脓毒症或脓毒症休克时，每延迟1 h使用抗生素，都可能导致死亡率增加。然而抗生素作为现代医学普遍认可的治疗脓毒症的药物，其对脓毒症引起的心肌损伤未见有效[51]。而且临床对抗生素的使用有严格要求，如具有安全一次性或快速输液优势的β-内酰胺类抗生素，虽可迅速进入血液发挥抗炎、抗菌作用，减轻患者全身及各器官脓毒症反应，但大量、长时间服用会产生耐药性和不良反应（如双硫仑样作用），因此其使用剂量和时间有一定限制。除了尽快开始抗生素治疗外，机械通气、纠正低氧和酸中毒、维持血压和心输出量等均是治疗脓毒症引起心肌损伤的重要治疗方式[59]，使用相应的治疗心血管损伤的药物，可减轻心肌损伤，但此类药物只是单纯的对症治疗，对脓毒症引发的心肌损伤仍有局限作用。近来有研究显示二甲双胍（Metformin）、生物活性肽（Alamandine）和右美托咪定（Dexmedetomidine）等药物均可通过调控心肌细胞自噬，进而减轻LPS诱导的心肌损伤[56，60-61]。但这些药物的具体作用机制尚未完全阐明，且未应用于临床。因此需要我们继续寻找和探索既能保护LPS诱导心肌损伤同时不良反应小的新药。

中医药在预防和治疗LPS诱导的心肌损伤中有巨大潜力，研究证实部分中药复方、单味药及活性成分可通过抗炎、抗心肌纤维化、抗氧化、抗凋亡等不同途径减轻LPS诱导的心肌损伤。中药复方如：1）强心一号复方由水红花子、黄芪、茯苓、丹参和五味子组成[62]，通过抑制脓毒症小鼠心肌细胞凋亡改善病理性心肌肥大;2）传统中药复方四逆汤由附子（制）、干姜、炙甘草组成，可降低脓毒症中晚期大鼠心肌细胞中TNF-α、IL-10等炎症介质的表达水平，改变大鼠体内炎症介质大量释放的状态，纠正大鼠心肌的免疫紊乱，從而减轻脓毒症大鼠心肌损伤[63-64]。单味药如：1）人参和西洋参，分别为五加科人参属植物人参和西洋参的根，可补气滋阴，提高机体免疫力，降低小鼠心肌细胞NADPH氧化酶2（NOX2）表达水平，从而使心肌细胞炎症介质超氧阴离子（O2-）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的生成减少，减轻LPS引发的心肌损伤[65];2）红花，为菊科植物红花的干燥花，常用来治疗心脏病和炎症，可以激活抗凋亡蛋白Bcl-2和p-Bad，下调Bax、细胞色素C、凋亡蛋白酶（Caspase-9、Caspase-3）和凋亡诱导因子表达，激活胰岛素样生长因子受体信号通路，抑制LPS诱导的H9C2心肌细胞凋亡[7]。中药活性成分如：1）麝香酮来源于麝科动物林麝或原麝成熟雄体香囊中的干燥分泌物麝香，可以显著下调脓毒症小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症介质的水平，抑制核因子κB，NLRP3炎性小体的活性，减轻心肌梗死后心脏组织巨噬细胞介导的炎症反应，保护心肌梗死后心脏组织[66];2）杨梅素（Myricetin）为杨梅科植物杨梅的树皮中提取的一种黄酮醇类化合物，能抑制一氧化氮合酶（iNOS）的过表达和氧化还原酶（SOD和GPx）活性的降低，通过抗炎，抗氧化减轻LPS诱导的心肌损伤[67];3）芦丁又称芸香苷，广泛存在于植物的花和果实中，具有抗氧化、抗炎的作用，可以减少LPS诱导的心肌纤维化[68];4）丹参酮ⅡA磺酸钠（Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate）为唇形科植物丹参的根提取分离得到的二萜醌类化合物，可以减缓LPS诱导的家兔血流动力学恶化，调节炎症介质分泌，减轻LPS造成的心肌损伤[69]。

近年來随着自噬研究的深入，自噬在维持心脏结构和功能中关键作用已被确认，以上药物能否通过调节自噬保护LPS诱导的心肌损伤具有极大的研究价值。另外其他具有心肌保护作用的中药复方及其提取物，如：丹参酮ⅡA、黄芪甲苷、木犀草素、紫荆黄酮、荭草苷、木酚素、丹酚酸B、加味丹参饮、芪丹理心丸、芪苈强心等，在不同心肌损伤模型中通过影响细胞自噬水平进而治疗心肌损伤的效果也被证实[57，70-74]，但能否通过调节自噬水平治疗LPS诱导的心肌损伤尚未得到证实。

6 讨论

自噬水平的改变是LPS诱导心肌损伤的重要病理改变，调节心脏自噬水平的变化能缓解LPS诱导的心肌损伤。最新研究提示，体内注射LPS导致心肌细胞内自噬流的迅速变化，自噬水平的变化与心肌的结构和功能密切相关。而通过多渠道调节心肌自噬水平显著减轻了LPS诱导的心肌损伤，这为临床治疗LPS引起的脓毒症提供了理论基础。传统中药能通过不同机制调节自噬，保护多种原因引起的心肌损伤。然而无论是从机制还是从药物筛选上，应用中药调节心肌自噬水平治疗脓毒症引起的心肌损伤的研究都十分缺乏，仍需进一步探索。

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（2020-09-01收稿 责任编辑：杨觉雄）