基于网络药理学和分子对接技术探讨药对赤芍-牡丹皮治疗银屑病的作用机制

刘琪琪 王春柳 支文冰 刘洋 李纯 周洁 张红 宗时宇 赵一丁 李晔

摘要 目的：基于網络药理学和分子对接技术研究赤芍-牡丹皮药对治疗银屑病的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库检索赤芍-牡丹皮的化学成分及其相关靶点，利用DisGeNET数据库检索银屑病相关靶点，通过Venny 2.1.0映射得到赤芍-牡丹皮治疗银屑病的交集靶点，利用STRING数据库及Cytoscape3.7.1构建交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），利用R语言进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析;利用Cytoscape3.7.1软件构建网络互作图。采用AutoDock4.2.1软件评价主要药效成分与核心靶点的结合作用力。结果：筛选得到赤芍-牡丹皮药对通过11个活性成分作用于70个交集靶点，通过调控细胞的氧化刺激反应和生物刺激反应等生物过程以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、辅助性T细胞17（TH17）细胞分化等相关途径共同发挥治疗银屑病作用。分子对接结果表明，赤芍-牡丹皮中槲皮素（Quercetin）、芍药苷（Paeoniflorin）、山柰酚（Kaempferol）、芍药醇（Baicalein）与AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF具有较好的结合能力。结论：通过网络药理学和分子对接技术系统地探讨赤芍-牡丹皮药对治疗银屑病的作用机制，为后期的实验提供了理论依据。

关键词 银屑病;网络药理学;分子对接;赤芍-牡丹皮

Abstract Objective：To explore the mechanism of the treatment of psoriasis by Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan by basing on network pharmacology.Methods：In this experiment，the active components and related targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan were searched by TCMSP database，and the targets related to psoriasis were searched by DisGeNET database.The intersecting targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of Psoriasis were obtained by Venny 2.1.0 mapping，and the interaction network map of intersecting targets was constructed by STRING database and Cytoscape3.7.1.（PPI）; R language was used for gene ontology （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis.The network interaction diagram was constructed by using Cytoscape3.7.1 software.AutoDock 4.2.1 software was used to evaluate the binding force of the main medicinal ingredients and the core target.Results：In this experiment，11 active components and 70 targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of psoriasis were obtained.By regulating the biological processes such as oxidative stimulation and biological stimulation of cells，as well as related pathways such as the mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway，helper T cell 17 （TH17） cell differentiation and other related pathways，they played a role in the treatment of psoriasis.The molecular docking results showed that Quercetin，Paeoniflorin，Kaempferol，Baicalein and AKT1，VEGFA，MAPK1，MAPK8，AKT1，JUN，TNF in the red peony cortex has good binding ability.Conclusion：Through the method of network pharmacology，this experiment systematically discusses the mechanism of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of psoriasis，which provides a theoretical basis for the later experiment.

Keywords Psoriasis; Network pharmacology; Molecular docking; Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.001

银屑病（Psoriasis）是一种表皮自稳状态异常的慢性炎症性皮肤病。据调查，全球发病率为0.9%～8.5%[1]，我国发病率為0.5%～4.6%[2]。由于银屑病发病特征的不同，又可分为斑块型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、关节病型银屑病等[3]。银屑病可引起炎症反应及心血管疾病等并发症，危害患者的身心健康[4]。现代医学认为银屑病与脂质代谢、免疫及炎症反应、细菌感染和精神心理等多种因素相关，其中机体内免疫功能紊乱是目前比较认可的主要发病机制[5]。现代医学治疗可引起身体不同程度的不良反应，无法根治。中医可根据患者不同体质，对证下药，达到标本兼治。

赤芍和牡丹皮是用于治疗血热证、血燥证银屑病代表性药物。赤芍、牡丹皮均为毛茛科植物[6]。赤芍（Paeoniae Rubra Radix）为毛茛科（Ranunculaceae）植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根，具有清热活血，化瘀止痛的功效[7]。芍药最早见于《神农本草经》，后《本草纲目》对赤芍、白芍加以区分，记载“白补而收，赤散而泻”[8]。牡丹皮（Cortex moutan）为毛茛科植物牡丹（Paeonol saffuruticosa Andr.）的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀的功效[9]。牡丹皮最早见于《神农本草经》，后汉末期张仲景所著《金匮要略》对牡丹皮的药用做了更进一步的论述[10]。赤芍-牡丹皮药对相须使用，协同增效，为活血化瘀常用药对，来源于金匮要略中“温经汤”[11]。根据研究报道，牡丹皮与赤芍均能抑制血小板凝集，二者配伍使用抑制作用增强[12]，可用于治疗血瘀型和血热型银屑病。

网络药理学利用生物信息学拓宽我们对药物作用的理解，从而促进药物发现。我们利用网络药理学建立药物靶点通路和网络，以预测赤芍-牡丹皮治疗银屑病可能的蛋白质靶点以及这些靶点与药物之间的主要相互作用。网络药理学能够从多种角度阐释中药多成分、多靶点、多通路、多疾病的药理作用机制。分子对接采用公共数据库和公开发表的已有数据，利用AutoDock4.2.0软件进行半柔性对接，研究蛋白质受体和药物小分子之间结合能力。目前对赤芍-牡丹皮治疗疾病的作用机制少见报道，本研究利用网络药理学及分子对接技术从系统和整体的层面来研究“赤芍-牡丹皮”治疗银屑病的药理机制，为今后研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药化学成分筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.Nwu.edu.cn/tcmsp.Php）检索赤芍-牡丹皮的所有化学成分，利用ADME参数，即口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选条件筛选活性成分[13]。

1.2 靶点筛选 利用TCMSP的检索赤芍-牡丹皮化学成分相关的靶点，并从UniProt数据库中（https：//www.uniprot.org），输入靶点蛋白名称限定物种为“Homo sapiens”，将所有蛋白名称的进行标准化。采用DisGeNET（http：//www.disgenet.org）寻找银屑病疾病靶点。将赤芍-牡丹皮及银屑病的靶点导入Venny 2.1.0得到韦恩图及交集靶点。

1.3 成分靶点蛋白相互作用分析 将赤芍-牡丹皮及银屑病的交集靶点导入String数据库（https：//string-db.org/）[14]中，输入靶点名称限定物种为“homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，导出node1、node2、combined score值导入Cytoscape软件，利用“Network Analyzer”计算赤芍-牡丹皮靶点PPI网络的拓扑学参数。并设置节点大小及颜色反映Degree值、Score值，最终得到PPI网络图。通过Cytoscape的插件Cytohubba获取PPI网络中连接度前10的hub蛋白质。

1.4 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将赤芍-牡丹皮药对及银屑病的34个交集靶点通过R软件中ClusterProfiler程序包进GO和KEGG通路富集分析。显著性阈值设为P≤0.05，做气泡图或条形图可视化。

1.5 网络构建与分析 将赤芍-牡丹皮药对中的化学成分，交际靶点导入Cytoscape3.7.1软件中，利用Cytoscape3.7.1软件中的Merge功能，构建中药-活性成分-靶点（Herb-component-target，H-C-T）网络图进行可视化分析，利用根据网络中的拓扑学参数分析，将中心度值（Betweenness Centrality，BC）、亲中心度值（Closeness Centrality，CC）、度值（Degree）进行分析，筛选出赤芍-牡丹皮度值较高的药效成分。将KEGG富集分析的通路及相关靶点导入Cytoscape3.7.1软件中，构建靶点-通路（Target-pathway，T-P）相关作用网络图。利用根据网络中的拓扑学参数分析，将BC、CC、Degree进行分析，筛选出赤芍-牡丹皮度值较高相关靶点。

1.6 分子对接 AutoDock软件中主要包含AutoGrid和AutoDock 2个程序。其中AutoGrid主要负责格点中相关能量的计算，而AutoDock则负责构象搜索及评价。利用RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载赤芍-牡丹皮治疗银屑病的相关靶点PDB格式文件，并利用PyMOL软件删除蛋白质水分子及多余的配体，利用TCMSP下载赤芍-牡丹皮的有效化合物mol2格式文件。通过AutoDock4.2.0软件中进行分子对接，在软件中分别对蛋白质及配体进行加氢、加电荷、加Root处理。辅助程序AutoGrid用于生成对接区，对接区定义为以配体结合位点为中心的60×60×60三维网格，网格间距为0.375。通过AutoDock tools计算对接结合能，探索化合物与靶标之间的结合相互作用。按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则，进行分子间相互作用的识别，并预测2个分子之间最佳的结合模式[15]。

2 结果与分析

2.1 赤芍-牡丹皮活性成分的筛选 共得到赤芍中有119个成分，牡丹皮中含有55个成分。根据OB≥30%，DL≥0.18筛选条件，共得到赤芍的29个活性成分，牡丹皮的11个活性成分。

2.2 赤芍-牡丹皮活性成分及靶點信息 共得到赤芍153个靶点，牡丹皮192个靶点。并从DisGeNET数据库中得出的银屑病靶点共有817个靶点，通过Venny 2.1.0映射得到TP53、JUN、IL6等70个赤芍-牡丹皮及银屑病的交集靶点。见图1。

2.3 交集靶点PPI网络的构建 该网络图共有70个节点，棱数290条。其Degree值越大，节点越大;Combine Score 值越大，颜色越明亮。Degree值越小，节点越小;Combine Score值越小，颜色越明亮。见图2。其中较大度值的IL6、MAPK1、MAPK3可能是治疗银屑病的重要靶点，并表明赤芍-牡丹皮药对治疗银屑病可通过多个靶点共同发挥疗效。本实验利用Cytoscape插件CytoHubba获得前10的hub蛋白质。见图3。表明银屑病可能通过连接度高的TP53、JUN、IL6等靶点发挥疗效，达到治疗目的。

2.4 GO功能分析 GO分为分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）、和细胞组分（Cellular Component，CC）3个部分。其中横坐标表示富集靶点的数目，P值代表富集靶点的显著性，P值越小，颜色越红，反之则偏向蓝色。在细胞组分中主要富集到细胞质、核转录因子、血小板、RNA聚合酶等;其分子功能主要富集到细胞因子受体结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、受体配体活性等;其生物过程主要涉及细胞的氧化刺激反应、细胞外刺激反应、生物刺激反应等。重点通路中圆圈代表富集靶点的数目，重点通路图中可得出TNF、MAPK1、MAPK3、VEGF，它们不仅作用于其中一条通路，还参与很多不同的途径，体现了中药多靶点、多通路的特点。见图4。

2.5 靶点蛋白KEGG通路分析 共富集在157条生物通路，选取有显著性差异的20条通路，做气泡图进行可视化。见图5。P值代表富集靶点的显著性，P值越小，颜色越红，反之则偏向蓝色。圆圈代表富集的靶点数目，圆圈越大，表示通路富集的靶点越多。体现了中药同一靶点可参与不同的生物学过程，并且通过改善生物过程达到治疗疾病的目的。

2.6 网络图构建分析 “中药-活性成分-靶点（H-C-T）”网络见图6。根据靶点可得出所对应的赤芍-牡丹皮药对的活性成分。见表1。儿茶素、芍药醇、槲皮素连接度最高。靶点-通路（T-P）网络见图7。得出BCL2、IL-6、TNF等靶点作用于TNF信号通路、Th17细胞分化、MAPK信号通路等通路治疗银屑病。活性成分的靶点可作用于不同的生物学通路，体现了中药成分多成分，多靶点，多通路的特征。

2.7 分子对接结果 赤芍-牡丹皮药对与靶点分子对接9个结果见图8。由于分子对接过程中的构想不同，结合能会产生许多不同的结果。赤芍-牡丹皮药对的分子对接结果见表2。赤芍-牡丹皮中槲皮素（Quercetin）、芍药苷（Paeoniflorin）、山柰酚（Kaempferol）、芍药醇（Baicalein）与AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF相关基因预测出治疗银屑病的最佳结合模式。

3 讨论

银屑病主要与炎症反应、免疫反应和细胞增殖有关。银屑病患者的特征性组织病理变化为内皮细胞增殖，免疫细胞，血管数量增加，通透性上升，真皮乳状头层微血管扩张迂曲[16]。赤芍-牡丹皮配伍有清热凉血、活血化瘀功效，可抑制银屑病内皮细胞过度增殖[17]，有效的治疗银屑病，提高患者生命质量。其中利用TCMSP数据库中筛选得到的活性成分中丹皮酚未达到ADME参数筛选条件，但已被证实与银屑病密切相关。韩朔[18]证实芍药苷可上调银屑病模型SOCS1基因表达水平，并对能够Jak-STAT信号通路下调血清中炎症介质表达水平，治疗银屑病效果显著[19-20]。丹皮酚可能通过下调MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路中细胞因子表达水平，能够有效地下调TNF的表达水平，达到抗炎的作用[21]。丹皮酚可抑制脂多糖诱导产生的细胞因子，同时也可诱导血管内皮细胞中TNF的释放，达到保护血管内皮细胞的机制[22]。赤芍-牡丹皮配伍中的活性成分能够通过调整炎症介质水平能够有效治疗银屑病。由此推测赤芍-牡丹皮药对中的代表性活性成分芍药苷和丹皮酚通过信号转导通路等达到治疗银屑病的目的，体现了赤芍-牡丹皮药对的多成分、多通路的作用机制。

通过GO富集分析发现，赤芍-牡丹皮治疗银屑病的基因在分子功能中主要富集到细胞因子受体结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、受体配体活性等;生物学过程中主要富集到细胞的氧化刺激反应、细胞外刺激反应、生物刺激反应等。其中赤芍-牡丹皮交集靶点中白细胞介素-6（IL-6）有强大的致炎性，能促进机体产生趋化因子，与受体结合产生大量炎症介质。IL-6与银屑病表皮细胞过度增殖的病理机制关系密切，并能诱导多种下游炎症介质形成炎症级联反应[23]。肿瘤坏死因子（TNF）由巨噬细胞分泌，可诱导某些肿瘤细胞系的细胞死亡，诱导细胞分化。TNF在银屑病中起重要作用，在炎症反应和免疫疾病中具有核心作用[24]。TNF水平升高可促进炎症介质IL-1β、IL-6、IL-8合成[25]。银屑病的发生机制与IL-6、TNF、IL-8等炎症介质有密切联系。根据GO富集分析得银屑病可通过调控炎症介质的表达、炎症介导途径、激酶传导途径等方面发挥治疗银屑病的作用[26]。赤芍-牡丹皮药对的主要活性成分通过调节炎症介质通路，细胞的外刺激反应和生物刺激反应等银屑病发病机制相关的信号转导通路发挥治疗银屑病的作用。

通过KEGG富集到157条通路，筛选出具有显著性差异的20条信号通路，其中Th17细胞分化（Th17 Cell Differentiation）通路上的IL-6、TNF、IL-1β靶点在促进皮肤组织炎症和损伤上是发挥协同调节作用的[27]。IL-6、TNF、IL-1β是Th17细胞分泌的最重要的前炎症介质，促进局部血管形成，加速表皮细胞增殖，加重局部炎症反应，导致病程迁延慢性化，通过下调炎症介质抑制银屑病表皮内皮细胞增殖，达到治疗银屑病的目的。MAPK信号通路接受刺激信号的传递，通过酶的级联反应把信号传递至细胞核内及调控下游因子[28]。银屑病的发病机制与角质形成细胞、炎症细胞、物理刺激等病理关系密切，MAPK信号通路异常可导致细胞异常增殖与分化[29]。MAPK信号通路通过炎症介质的调控有效地降低银屑病的炎症反应[30]。由此推测，赤芍-牡丹皮药对在治疗银屑病过程中参与Th17细胞分化、MAPK信号通路等信号转导通路达到治疗银屑病的目的。

分子对接证明赤芍-牡丹皮中药效成分槲皮素、芍药苷、山柰酚、芍药醇与AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF均小于-5 kcal/mol，具有较好的结合能力。推测赤芍-牡丹皮的药效成分可能通过作用于相关靶点发挥治疗作用。

综上所述，运用网络药理学方法分析赤芍-牡丹皮药对银屑病的作用机制，分析筛选得到该药对中可能的芍药苷、丹皮酚、槲皮素等11个活性成分，以及IL6、IL-1β、TNF、VEGFA、MAPK8、MAPK3等70个作用靶点。同时，通过GO富集分析得到了赤芍-牡丹皮药对治疗银屑病涉及的细胞氧化刺激反应和生物刺激反应等生物过程;KEGG富集分析得到赤芍-牡丹皮药对治疗银屑病涉及的Th17细胞分化、MAPK信号通路和TNF信号通路等27条信号通路及分子对接预测到活性成分与靶点的最佳结合模式，可以为进一步进行赤芍-牡丹皮配伍治疗银屑病的多重药理作用机制研究提供参考。

参考文献

[1]王强.基于网络药理及分子对接探讨断藤益母汤靶向MAP3K2治疗类风湿关节炎的作用机制[D].广州：广州中医药大学，2019.

[2]丁晓岚，王婷琳，沈佚葳，等.中国六省市银屑病流行病学调查[J].中国皮肤性病学杂志，2010，24（7）：598-601.

[3]朱愿超，孙雪林，胡欣.银屑病治疗靶向药物的研究进展[J].中国药房，2019，30（4）：542-547.

[4]Gelfand JM，Mehta NN.Aortic valve stenosis：a new cardiovascular comorbidity of psoriasis？[J].Eur Heart J，2015，36（32）：2134-2135.

[5]刘正君.T细胞亚群及相关细胞因子异常在银屑病发生发展中的作用机制研究[D].青岛：青岛大学，2018.

[6]章丽，赵冰洁，袁嘉瑞，等.基于“组分结构”理论对牡丹皮、赤芍和白芍化学成分的对比研究[J].中国中药杂志，2016，41（10）：1835-1842.

[7]王化，何丹娆，朱良玉，等.HPLC法同时测定赤芍中9个活性成分的含量[J].中草药，2018，49（3）：708-711.

[8]陆小华，马骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46（4）：595-602.

[9]韩宁宁，张振凌，林秀敏，等.响应面法-中心复合法试验优选炒牡丹皮炮制工艺[J].中华中医药学刊，2020，38（2）：20.

[10]周永军，魏尊喜.牡丹皮的研究概况[J].中国药业，2012，21（16）：111-112.

[11]姜雅晴.温经汤合并西药治疗月经不调85例疗效分析[J].中国现代药物应用，2008，2（1）：73-74.

[12]张欢，何丽丽.牡丹皮、赤芍配伍对活血化瘀疗效及有效成分的影响[J].中国现代医学杂志，2019，29（7）：13-17.

[13]Li Y，Zhang J，Zhang L，et al.Systems pharmacology to decipher the combinational anti-migraine effects of Tianshu formula[J].J Ethnopharmacol，2015，174：45-56.

[14]Szklarczyk D，Franceschini A，Kuhn M，et al.The STRING database in 2011：functional interaction networks of proteins，globally integrated and scored[J].Nucleic Acids Res，2011，39（Database issue）：D561-568.

[15]任洁，魏静.分子对接技术在中药研究中的应用[J].中国中医药信息杂志，2014，21（1）：123-125.

[16]张秀钦，程波，方芳.银屑病患者皮损间充质干细胞分泌IL-8、IL-11、HGF、VEGF水平的免疫發病机制探讨[J].黑龙江医药，2018，31（6）：1385-1387.

[17]谈依菱.基于数据挖掘研究当代名老中医治疗银屑病方药证治规律[D].广州：广州中医药大学，2017.

[18]韩朔.芍药苷、丹皮酚对HaCaT细胞银屑病模型SOCS1及其炎症介质表达的研究[D].北京：北京中医药大学，2016.

[19]李培培.BAFF/BAFF-R介导PI3K-AKT-mTOR信号通路上调胶原性关节炎大鼠B淋巴细胞的功能及芍药苷的调节作用[D].合肥：安徽医科大学，2012.

[20]Chen D，Li Y，Wang X，et al.Generation of regulatory dendritic cells after treatment with paeoniflorin[J].Immunol Res，2016，64（4）：988-1000.

[21]Jin X，Wang J，Xia Z M，et al.Anti-inflammatory and Anti-oxidative Activities of Paeonol and Its Metabolites Through Blocking MAPK/ERK/p38 Signaling Pathway[J].Inflammation，2016，39（1）：434-446.

[22]Liu YR，Chen JJ，Dai M.Paeonol protects rat vascular endothelial cells from ox-LDL-induced injury in vitro via downregulating microRNA-21 expression and TNF-α release[J].Acta Pharmacol Sin，2014，35（4）：483-488.

[23]余靖宏，趙瑞芝，卢传坚.芍苓汤对豚鼠心得安模型及HaCaT细胞炎症介质IL-6、IL-17A和IL-22mRNA表达的影响[J].中药新药与临床药理，2014，25（5）：552-555.

[24]Arican O，Aral M，Sasmaz S，et al.Serum levels of TNF-alpha，IFN-gamma，IL-6，IL-8，IL-12，IL-17，and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity[J].Mediat Inflamm，2005，2005（5）：273-279.

[25]Soubrier M，Jouanel P，Mathieu S，et al.Effects of anti-tumor necrosis factor therapy on lipid profile in patients with rheumatoid arthritis[J].Joint Bone Spine，2008，75（1）：22-24.

[26]姜蔚蔚，张春雷.银屑病发病机制相关信号通路研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2018，34（6）：378-381，384.

[27]王娟，鲍海平.寻常型银屑病皮损中IL-17和TNF-α的表达[J].山西大同大学学报：自然科学版，2018，34（6）：48-50.

[28]贺旭峰，丁佩军，张慧敏.银屑病关节炎与MAPK信号通路[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2016，15（2）：128-130.

[29]赵海生，顾军.MAPK信号转导通路与银屑病[J].中国皮肤性病学杂志，2007，21（3）：184-186.

[30]王胜珊.银屑病发病诊断及治疗中的MPAK/NF-kB信号通路作用[J].解剖学研究，2017，39（6）：468-471，486.

（2020-08-26收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）