药用植物青蒿不同种类的内生菌抑菌活性分析

摘 要： 為了研究青蒿不同种类的内生菌抑制细菌和抑制真菌的活性，该研究采用组织块法和研磨法从青蒿的根、茎、叶中分离内生细菌、放线菌和真菌，以大肠埃希菌（Escherichia coli）（CICC 23657）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（CICC 10275）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC 10384）、黑曲霉（Aspergillus niger）（CICC 2487）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（CICC 33032）为指示菌，采用琼脂块法和双层平板法检测内生菌的抑菌活性。结果表明：（1）从青蒿植株中共分离到76株内生菌，其中内生细菌19株、内生放线菌34株、内生真菌23株。从分离部位来看，56株来自于茎段、17株来自于根段、3株来自叶片。（2）内生细菌中抑菌活性菌株占总菌株的比例最高，为95%，内生放线菌和内生真菌中抑菌活性菌株的比例分别为41%、35%。（3）内生细菌的抗菌谱较广;虽然内生放线菌的抗菌谱较窄，但其中高抗菌株较多，尤其对酿酒酵母的抑菌效果好。综上结果显示，药用植物青蒿中存在着丰富的有抑菌活性的内生菌，且不同种类的内生菌抑菌活性不同。

关键词： 青蒿， 内生细菌， 内生放线菌， 内生真菌， 抑菌活性

中图分类号： Q939  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1112-08

Abstract： In order to study the antimicrobial activity of different species of endophytes from Artemisia annua against bacteria and fungi， and provide the basis for the production of natural antimicrobial substances by endophytes. Endophytes were isolated from the roots， stems and leaves of A. annua by tissue isolation and grinding methods. With five representative microorganisms， Escherichia coli CICC 23657， Bacillus subtilis CICC 10275， Staphylococcus aureus CICC 10384， Aspergillus niger CICC 2487 and Saccharomyces cerevisiae CICC 33032 were used as indicating microorganisms， the antimicrobial activity of endophytes were detected by agar block method and double layer agar plate method. The results were as follows： （1） A total of 76 strains of endophytes were isolated from A. annua， including 19 strains of endophytic bacteria， 34 strains of endophytic actinomycetes and 23 strains of endophytic fungi. According to the plant parts of endophytes isolated， 56 strains were isolated from the stems， 17 from the roots and 3 from the leaves. （2）Among the endophytic species， 95% of the bacteria， 41% of the actinomycetes and 35% of the fungi showed antimicrobial activity， respectively. （3）The antimicrobial spectrum of endophytic bacteria was broad， while antimicrobial spectrum of endophytic actinomycetes was narrow， but there were many strains of endophytic actinomycetes with high antimicrobial activity， especially some strains of endophytic actinomycetes had strong antimicrobial activity against Saccharomyces cerevisiae. It can be seen that there are abundant endophytes with antimicrobial activity in A. annua， and different species of endophytes from A. annua showed different antimicrobial activity.

Key words： Artemisia annus， endophytic bacteria， endophytic actinomycetes， endophytic fungi， antimicrobial activity

植物内生菌是一类重要的微生物资源，从20世纪90年代起逐渐成为微生物学家们关注的热点（赫荣乔，2009;Wang & Dai， 2011;Sheng et al.， 2011）。近年来，越来越多的研究证明内生菌可产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物，因此，从植物内生菌中获得各种新资源是很有可能的（陈向东，2012）。药用植物青蒿中最有价值的化学成分是青蒿素。青蒿素是目前治疗疟疾最有效的药物，我国科学家屠呦呦因为发现青蒿素而获得了2015年度的诺贝尔奖（张铁军等，2016），而且这一成果正在申请新药——可用于治疗红斑狼疮。药用植物青蒿中可能存在着能产生青蒿素的内生菌，而青蒿素具有抗菌作用（文学，2009）。从青蒿中寻找有抗菌活性的内生菌，进一步研究其代谢产物，有助于找到产青蒿素的内生菌。

国内外关于内生菌的研究报道虽然很多，但关于青蒿内生菌的研究报道较少。刘金花等（2011）从黄花蒿的根、茎和叶中分离到内生菌80株，通过形态观察对内生菌的种类进行了初步鉴定;钱一鑫等（2014）对68株青蒿内生真菌的抗肿瘤抗氧化活性进行研究，筛选到8株内生真菌具有细胞毒活性，5株内生真菌有清除DPPH自由基活性;田小曼等（2008）从青蒿中分离到63株内生菌，以棉花枯萎病菌等12种农作物病原真菌为靶标菌，研究内生菌的抗病原真菌活性，筛选到1株内生真菌、9株内生细菌和3株内生放线菌有较高抗菌活性;魏宝阳等（2008）从黄花蒿茎中分离到13株内生真菌，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为指示菌，研究内生真菌的抗细菌活性，发现12株内生真菌的代谢产物至少对1种指示细菌有抑菌活性。目前尚未发现青蒿内生细菌、内生放线菌和内生真菌抗细菌和抗真菌活性的全面研究。

本研究以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示细菌，以酿酒酵母和黑曲霉为指示真菌，全面研究青蒿内生细菌、内生放线菌和内生真菌对指示细菌和指示真菌的抑制效果，为今后青蒿内生菌产天然抑菌物质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药用植物标本 健康、无病虫害野生青蒿的完整植株，9月份采自重庆市涪陵区蒿枝坝山上，取样后流水冲洗干净，分别取下其根、茎、叶，1 d内处理完毕。

1.1.2 供试指示菌 本研究所用的指示细菌和指示真菌均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，指示细菌中的大肠埃希菌为革兰氏阴性，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，指示真菌有黑曲霉和酿酒酵母，具体如表1所示。

1.1.3 培养基 培养基名称及用途如表2所示。

1.2 内生菌的分离纯化

青蒿的根、茎、叶经5.4%次氯酸钠表面消毒一定时间（根和茎各10 min，叶5 min）、无菌水漂洗后，无菌条件下，将根和茎切成1 cm左右的小段，叶进行研磨。将根、 茎小段和0.1 mL叶的研磨上清液分别接种在牛肉膏蛋白胨、高氏I号和PDA平板上，放在合适的温度下培养，从中分离内生细菌、放线菌和真菌。

消毒可靠性检验采用漂洗液检查法和组织印迹检查法（李玲玲等，2019）。

分离成功后采用平板划线的方法进行纯化。

1.3 内生真菌抑菌活性初筛

内生真菌培养：挑取经活化的内生真菌菌丝或孢子点接至PDA固体平板中央，28 ℃恒温培养7 d，备用。

指示细菌培养：将三种指示细菌分别接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，37 ℃培养18 h。

抑菌初筛试验：采用琼脂块法（李玲玲等，2015）。

1.4 内生菌发酵上清液抑菌活性测定

1.4.1 指示菌培养 将三种指示细菌分别接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，36 ℃培养18 h;将酿酒酵母、黑曲霉接种于PDA斜面上，28 ℃分别培养2、7 d。

1.4.2 内生菌上清液的制备 内生菌的培养：将分离到的内生细菌分别接入100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入36 ℃摇床，培养24 h;将分离到的内生放线菌分别接入100 mL高氏I号液体培养基中，放入28 ℃摇床，培养5d;将分离到的内生真菌分别接入100 mL PDA液体培养基中，放入28 ℃摇床，培养5 d。

内生菌上清液的制备：将培养好的内生菌菌悬液分别移入灭菌离心管中，12 000 r·min-1，离心10 min，小心吸出上清液，转移至新的灭菌离心管中，用于抑菌活性筛选。

1.4.3 内生菌发酵上清液抑菌活性筛选 采用双层平板法（李玲玲等，2015）。将滴碟后的双层平板先放入4 ℃冰箱預培养7 h，然后将接有供试细菌的双层平板置于36 ℃恒温培养18 h;接有供试酿酒酵母和黑曲霉的双层平板置于28 ℃分别恒温培养2、5 d。观察并测量抑菌圈直径。

1.5 数据分析

抑菌圈大小采用三次试验重复测量，采用SPSS Statistics 17.0软件进行统计分析，数据由平均值±标准差表示。

2结果与分析

2.1 青蒿内生菌的分离结果

各种消毒可靠性检验平板上均未长菌，内生菌分离平板上长菌，证明分离成功。从分离成功的平板上挑选不一样的菌落或菌苔进行划线纯化，直至得到纯化的典型菌落。根据划线纯化过程中菌落的形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征不同，统计分离出的菌株数。由表3可知，从青蒿根、茎、叶中共分离到内生菌76株，其中内生细菌19株、内生放线菌34株、内生真菌23株。从分离部位来看，76株内生菌中：56株来自于茎段;17株来自于根段;仅3株来自于叶内。表明茎段的内生资源较丰富。

为了便于区分，将从青蒿根内分离到的内生细菌、内生放线菌、内生真菌菌株分别标记为蒿根细1-3、蒿根放1-11、蒿根真1-3;从茎内分离到的内生细菌、内生放线菌、内生真菌菌株分别标记为蒿茎细1-15、蒿茎放1-22、蒿茎真1-19;从叶内分离到的内生细菌、内生放线菌、内生真菌菌株分别标记为蒿叶细1、蒿叶放1、蒿叶真1。

2.2 内生真菌抑菌活性初筛

采用琼脂块法初步检测23株内生真菌对3种供试细菌的抑菌活性，检测到有6株内生真菌对供试细菌有抑菌活性，结果如表4和图1所示。

从初筛效果来看，仅蒿茎真1和蒿茎真16菌株对3种供试细菌的抑菌效果较好。青蒿内生真菌对供试细菌的抑菌效果整体较差，有抑菌活性菌株的比例仅为26.0%。

2.3 内生细菌发酵上清液抑菌活性检测结果

对19株内生细菌（3株来自于根段，15株来自于茎段，1株来自于叶）的发酵上清液进行抑菌活性检测，检测到18株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例为95%（表5）。

总体上看，青蒿内生细菌中有抑菌活性的菌株比例较高、抑菌谱较广，对于供试真菌和细菌均表现出一定的抑菌作用;有抑菌活性的内生细菌共有18株，其中14株来自于茎段。

2.4 内生放线菌发酵上清液抑菌活性检测结果

对34株内生放线菌（11株来自于根段，22株来自于茎段，1株来自于叶）的发酵上清液进行抑菌活性检测，检测到14株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例为41%（表6和图2）。

总体上看，青蒿内生放线菌中有抑菌活性的菌株抗菌谱较窄，多数菌株仅对一种供试菌有抑菌活性，所有内生放线菌均未对大肠埃希菌表现出抑菌活性。但是，内生放线菌对供试真菌的抑菌效果较好，有抑菌活性的菌株多数为高抗菌株，特别是对酿酒酵母的抑菌效果好。由表6和图2：A可知，蒿根放8（HG8）发酵上清液对指示菌黑曲霉的抑菌圈直径达到了2.7 cm;由表6和图2：B-D可知，蒿根放11（HG11）、蒿根放3（HG3）、蒿茎放12（HJ12）发酵上清液对指示菌酿酒酵母的抑菌圈直径分别达到3.5、2.7、1.6 cm。

2.5 内生真菌发酵上清液抑菌活性检测结果

对23株内生真菌（3株来自于根段，19株来自于茎段，1株来自于叶）的发酵上清液进行抑菌活性检测，检测到8株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例为35%（表7）。

总体上看，青蒿内生真菌中有抑菌活性的菌株比例较低，抑菌效果也较差，特别是对金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的抑菌效果差。

3 讨论与结论

从药用植物中分离、筛选能够产生与宿主植物相同或相似生物活性物质的内生菌已成为筛选微生物药物的重要来源，特别是以抗菌、抗肿瘤等指标为主的药物开发，是植物内生微生物研究中最耀眼的亮点（王志伟等，2014）。药用植物青蒿化学成分中的挥发油和青蒿素都具有抗菌作用（文學，2009;张丽勇等，2011）。青蒿内生菌长期与青蒿共存，可能产生青蒿挥发油或青蒿素，从而使内生菌具有抑菌作用。

研究中发现青蒿不同种类的内生菌抗菌谱不同，内生细菌的抗菌谱较广，内生放线菌的抗菌谱较窄，这一结果与李洁（2010）的研究结果（31株黄花蒿内生放线菌的抗菌活性谱广）不太一致，这可能与采用不同地区的青蒿植株分离内生菌，青蒿植株代谢产物不同， 导致它们的内生菌产生的代谢产物不同有关。内生放线菌中高抗菌株较多，尤其对酿酒酵母的抑菌效果好，这将为今后从青蒿内生菌中筛选具有广谱和选择性的抗菌药物提供依据。

在研究青蒿内生真菌抑菌活性时发现，青蒿的23株内生真菌中仅5株有抑细菌活性，抑菌效果也较差（最大抑菌圈直径10.8 mm）;而魏宝阳等（2008）的研究显示13株黄花蒿内生真菌中12株有抑细菌活性，且有两株抑制病原细菌的活性较强（抑菌圈直径>26 mm）。两项研究中有抑菌活性的菌株比例不同，抑菌活性大小也不同，这可能与内生真菌发酵产物处理方法不同有关。魏宝阳等（2008）研究内生真菌代谢产物活性时，发酵液经过滤、乙酸乙酯萃取和浓缩后用于抑菌活性检测;而本研究内生真菌的发酵液离心后直接收集上清液检测抑菌活性，由于发酵产物未经浓缩，可能导致部分抑菌活性较弱的内生真菌未被检测出。

本研究只是对内生菌发酵上清液的抗菌活性进行了研究，未对产生抑菌活性的物质进行分析，因此，今后还需对青蒿内生菌进一步研究：（1）抑菌效果好的内生菌的发酵条件、抑菌物质的提取方法以及化学结构。（2）具有抑菌活性的内生菌是否产青蒿素。以期为内生菌发酵产天然抑菌物质或青蒿素提供依据。

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（责任编辑 周翠鸣）