黔产钩藤茎、叶化学成分及抗肿瘤活性研究

刘扬 张妮 罗俊 王苗苗 潘卫东

摘 要： 鉤藤富含生物碱类成分且资源丰富，具有清热平肝、息风定惊等作用。为明确钩藤茎、叶的物质基础，该文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20及半制备 HPLC 等色谱技术对其进行分离纯化，根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构，并采用 MTT 法对人白血病细胞株 K562、HEL 进行体外抗肿瘤活性筛选。从钩藤茎中分离得到7个化合物，分别鉴定为3，4，5-三甲氧基苯酚（1），东莨宕素（2），异去氢钩藤碱（3），去氢钩藤碱（4），Vallesiachotamine（5），异钩藤碱（6），钩藤碱（7）。从钩藤叶中分离得到12个化合物，分别鉴定为二十八烷醇（8），β-谷甾醇（9），三十烷酸（10），2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside（11），齐墩果酸（12），槲皮素（13），常春藤苷元（14），山柰酚（15），（6R， 9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16），熊果酸（17），表儿茶素（18），大黄素甲醚（19）。结果表明：（1）化合物3、5对HEL细胞有抑制作用，IC50值分别为17.96、73.01 μg·mL-1;化合物5对K562细胞有抑制作用，IC50值为16.45 μg·mL-1，表明钩藤茎化学成分有一定的抗肿瘤活性。（2）化合物1， 8， 10， 16均为首次从钩藤植物中分离得到。该研究可为钩藤植物资源的合理开发与可持续利用提供科学依据。

关键词： 钩藤， 化学成分， 分离纯化， 结构鉴定， 抗肿瘤活性

中图分类号： Q946.91  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1061-09

Abstract： Uncaria rhynchophylla contains large amount of alkaloids and abounds in natural resources， and has the function of heat-clearing for calming liver and wind-calming for calming frightened. In order to make clear the material basis of stems and leaves of U. rhynchophlla， in this paper， the chemical constituents of stems and leaves from U. rhynchophylla and their antitumor activities were studied. The extracts were isolated and purified by using silical gel， Sephadex LH-20， semi-HPLC， and the structures of the compounds were identified by physicochemical property and spectrum analysis. The antitumor activities of chemical constituents against K562， HEL cell lines were assessed by MTT method. Seven compounds were isolated and identified from stems of U. rhynchophylla as 3， 4， 5-trimethoxyphenol（1），scutellarin（2）， isohydrohydrogenine（3）， dehydroramine（4）， Vallesiachotamine（5）， isorhynchophylline（6）， rhynchophylline（7）. Twelve compounds were isolated and identified from leaves of U. rhynchophylla as octadecanol（8）， β-sitosterol（9）， tridecanoicacid（10）， 2-methyl-5，7-dihydroxy-chroone-7-O-β-D-glucopyranoside（11）， oleanolic acid（12）， quercetin（13）， ivy aglycone（14）， kaempferol（15）， （6R， 9R ）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16）， ursolic（17）， epicatechin（18）， emodin methylether（19）. The results of antitumor activities were as follows： （1） Compounds 3 and 5 inhibited the activities of HEL cell lines， and IC50 values were 17.96 and 73.01 μg·mL-1; Compound 5 inhibited the activities of K562 cell lines， and IC50 values were 16.45 μg·mL-1， which indicate that some compounds from stems of U. rhynchophylla have certain antitumor activities. （2） Compounds 1， 8 ，10 and 16 were isolated from this plant for the first time. This study shed the scientific light on reasonable utilization and sustainable development of plant resources.

Key words： Uncaria rhynchophylla， chemical constituents， isolation and purification， structure identification， antitumor activity

钩藤，是茜草科植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）、大叶钩藤（U. macropylla）、毛钩藤（U. hirsute）、华钩藤（U. sinensis）或无柄果钩藤（U. sessilifucus）的干燥带钩茎枝，常用以眩晕欲仆、癫痫抽缩、高烧惊厥、伤风夹惊、儿童惊啼、受孕子痫等症状（国家药典委员会，2015）。其主要产自于我国的赣、粤、桂、湘、滇、黔等省（区）（高晓宇等， 2017）。钩藤作为贵州省的道地药材之一，在贵州的剑河、丹寨、锦屏、榕江、开阳等30多个县市均有种植（杨琳等， 2014）。

钩藤的化学成分类型较为多样，包括生物碱类、黄酮类、三萜类、甾醇类、多酚类、挥发油类以及糖苷类等（Wang & Sun，2010;Zhang & Huang，2020）。其中，生物碱类为钩藤最主要的有效成分，按照结构类型可进一步分成吲哚类以及氧化吲哚类两大类（Cai et al.， 2019）。前人对其药用部位研究比较多，而对于非药用部位报道较少。为了更进一步开发利用，避免资源的浪费，本文针对钩藤非药用部位茎、叶化学成分展开了初步的探究，从钩藤的茎中分离总共得到7个化合物（图1），分别鉴定为3，4，5-三甲氧基苯酚（1），东莨宕素（2），异去氢钩藤碱（3），去氢钩藤碱（4），Vallesiachotamine（5），钩藤碱（6），异钩藤碱（7）。从钩藤的叶中分离总共得到12个化合物，分别鉴定为二十八烷醇（8），β-谷甾醇（9），三十烷酸（10），2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside（11），齐墩果酸（12），槲皮素（13），常春藤苷元 （14），山柰酚（15），（6R，9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16），熊果酸（17），表儿茶素（18），大黄素甲醚 （19）。化合物1， 8，10，16均为首次从该植物中分离得到。抗肿瘤活性结果表明，化合物3和5 对HEL细胞的抑制作用较强，化合物5对K562细胞的抑制作用较强。本研究丰富了钩藤的化学物质基础，也为更加全面系统地开发以及合理利用钩藤资源提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

仪器：INOVA-400 MHz 核磁共振波谱仪（美国Varian公司，WIPM-500 MHz 核磁共振仪（中科院武汉数学物理研究所），600 MHz超导核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司），Waters 2545高效液相色谱仪（美国Waters 公司），美国HP-5973型质谱仪，HP1100-MSD型液质联用仪，Sephadex LH-20凝胶（40 ～ 70 μm， 默克），混匀机（IKA公司），冻存管（Corning）细胞培养皿（NEST），超低温冰箱（Thermo 公司），细胞培养箱（Thermo 公司），96孔板（NEST），超净工作台（Thermo 公司），荧光倒置显微镜（Zeiss公司），Fetal bovine serum（Hyclone），控温摇床（IKA公司），Milli-Q 超纯水仪（Millipore 公司），水浴锅（Grant公司），DEME。柱层析硅胶（200～300目和300～400目），薄层层析硅GF254（0.20～0.25 μm）（青岛海洋化工工厂），Sephadex LH-20 （MERCK 公司），低温离心机（BECKMAN 公司），细胞培养瓶（NEST），超净工作台（Thermo 公司），移液管（Fischer），离心管（NEST），细胞培养皿（NEST），高压灭菌锅（上海申博化工有限公司）。

试剂：甲醇、乙醇、石油醚（上海泰坦科技股份有限公司），多功能酶标仪（Gene 公司），Trypsin（Gibico），双抗（青霉素+链霉素），MTT（Sigma），MCI GEL CHP20P（日本三菱化学公司）。

材料由贵州省丹寨县兴仁镇昌昊金煌（贵州）中药有限公司种植基地提供，经贺定翔中药师鉴定为茜草科（Rubiaceae）钩藤属（Uncaria Schreb.）钩藤（Uncaria rhynchophylla）的茎枝及叶。

1.2 提取和分离

干燥钩藤的茎15.0 kg，粉碎后用浓度为90%的乙醇（每次50 L）加热回流提取3次，合并提取液，减压蒸馏浓缩除去有机溶剂后得粗提物。用浓度为5%的盐酸溶解浸膏，过滤得到滤液;用饱和氢氧化钠溶液调节滤液的pH，使其至 pH=9;分别用氯仿萃取4次，合并氯仿层，减压回收溶剂，得氯仿层200.0 g。取氯仿部位浸膏200.0 g，加适量溶剂溶解，用60～80目、质量约为350.0 g的硅胶拌样，经300～400目、质量约为2.0 kg的硅胶进行柱层析，用（氯仿-甲醇100∶1 → 0∶1）进行梯度洗脱。每次接馏分约为800 mL，减压浓缩回收溶剂。将浓缩后的组分用薄层色谱（TLC）展开，分别观察组分在紫外灯下的荧光显色和浓度为5%磷钼酸的显色情况，合并相似的部分，一共分成9段（Fr.1～ Fr.9）。第Fr.2 段（5.0 g）經 MCI 柱层析（甲醇-水20∶80 → 100∶0）洗脱分为 6 段。Fr.2-1（505.2 mg）反复经过硅胶柱梯度洗脱（石油醚-乙酸乙酯10∶1 → 1∶1），得化合物1（6.0 mg）和2（7.0 mg）。将Fr.2-6（240.3 mg）进行重结晶后得化合物3（5.0 mg）。将Fr.2-5（1.3 g）部分经过反复硅胶柱层析及半制备高效液相色谱分离后得化合4（3.2 mg）和5（6.0 mg）。将Fr.3（4.0 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱（甲醇-水 1∶1）、硅胶柱梯度洗脱（石油醚-乙酸乙酯8∶1 → 2∶1）的过程，再经过半制备高效液相分离，得化合物6（15.3 mg）和7（4.0 mg）。

干燥钩藤的叶7.5 kg，粉碎后，用90% 的乙醇（每次25 L）回流提取3次，合并提取液。减压蒸馏浓缩除去有机溶剂后得粗提物，将得到的总浸膏加入适量的水混悬。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，再減压回收溶剂。分别获得石油醚部位浸膏（5.0 g），乙酸乙酯部位浸膏291.0 g，正丁醇部位浸膏330.0 g。称取钩藤叶乙酸乙酯部位的浸膏（291.0 g），加入适量的有机溶剂，使其充分溶解，称60～80目的硅胶约为500.0 g拌样，称300～400目的硅胶约3 kg进行柱层析分离，用（氯仿-甲醇100∶1 → 0∶1）进行梯度洗脱。每次接馏分约为800 mL，减压浓缩，用薄层色谱展开，将相似组分合并。将氯仿的萃取部分总共分成11段（Fr.1～ Fr.11）。把第Fr.3段（3.0 g）经MCI柱层析（甲醇-水 20∶80 →100∶0）洗脱，共分为6段。把Fr.3-1（820.1 mg）段用硅胶柱洗脱（石油醚-乙酸乙酯 20∶1→ 5∶1），得化合物 8（20.0 mg），9（15.2 mg）。Fr.4段（6.0 g）经硅胶柱梯度洗脱（石油醚-乙酸乙酯 100∶1→ 10∶1），共分为7段（Fr.4-1～Fr.4-7）。Fr.4-5（1.5 g）段经硅胶柱洗脱（石油醚-乙酸乙酯10∶1），得化合物10（8.0 mg），11（5.0 mg）。将Fr.4-7（602.4 mg），经甲醇重结晶，得化合物12（6.1 mg）。Fr.6段（5.0 g）经硅胶柱梯度洗脱（石油醚-乙酸乙酯50∶1→ 10∶1），共分为 9 段（Fr.6-1～Fr.6-9）。Fr.6-4（1.6 g）段经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇-氯仿1∶1）洗脱，得到化合物13（6.3 mg）。Fr.6-9（ 803.2 mg）段经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇-氯仿 1∶1）洗脱，后经高效液相半制备分离，得化合物14（6.3 mg）、15（6.2 mg）和16（3.0 mg）。Fr.7段（6.0 g）经MCI柱层析（甲醇-水30∶70→ 100∶0）后，再通过反复硅胶柱梯度洗脱（石油醚-乙酸乙酯20∶1→ 0∶1）和Sephadex LH-20凝胶柱（50% 甲醇）分离以及半制备高效液相分离，得化合物17（25.1 mg）、18（20.3 mg）、19（8.2 mg）。

1.3 抗肿瘤活性实验

采用MTT法测定钩藤茎、叶中化合物对人白血病细胞株K562、HEL的增殖抑制作用。选用对数期细胞，选用10%小牛血清的RPMI1640培养基配制细胞悬液。接种于96孔板，使每孔细胞为8 000个，将96孔板置于5% CO2培养箱中，过夜，待细胞完全适应环境。将待测化合物用DMSO配成5个浓度梯度的培养基。阳性对照用紫杉醇，阿霉素，长春新碱，顺铂和5-氟尿嘧啶配置成等浓度梯度。阴性对照为等体积0.25% DMSO的培养基，每组设5个复孔。加药后，培养48 h。离心去除上清液，加入5 mg·mL-1MTT的培养基。在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育4 h。取出96孔板，弃除上清液，加入DMSO，恒温摇床37 ℃避光，至甲瓒晶体充分溶解。于酶标仪490 nm处，测OD值。细胞存活率（%）=（实验组OD-空白对照组OD）/（对照组OD-空白对照组OD）×100;抑制率（%）=100%-细胞存活率（%）;半数抑制浓度IC50=lg-1[Xm-i×（P-0.5）]，式中：i表示（最大剂量/相邻剂量）的对数值;Xm表示最大浓度对数值;P表示各浓度抑制率之和。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1： 白色无定形粉末。ESI-MS m/z： 207 [M + Na]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 6.09（2H， s， H-2， 6）， 3.81（6H， s， 3， 5-OCH3）， 3.78（3H， s， 4-OCH3）. 13C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 153.8（C-3， 5）， 152.3（C-1）， 131.9（C-4）， 92.9（C-2， 6）， 61.1（4-OCH3）， 56.0（3， 5-OCH3）。以上数据与文献（DE Oliveira et al.， 2014）对照基本一致，故鉴定该化合物为3，4，5-三甲氧基苯酚。

化合物2： 白色粉末。ESI-MS m/z： 215 [M + Na]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 7.60（1H， d，J=9.5 Hz， H-4）， 6.92（1H， s， H-5）， 6.85（1H， s， H-8）， 6.27（1H， d，J= 9.5 Hz， H-3）， 3.96（3H， s， 6-OCH3）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 161.5（C-2）， 149.7（C-6， 9）， 144.0（C-7）， 143.3（C-4）， 113.4（C-5）， 111.5（C-3）， 107.5（C-10）， 103.2（C-8）， 56.4（6-OCH3）。以上数据与文献（Ma et al.， 2009）对照基本一致，故鉴定该化合物为东莨宕素。

化合物3： 白色粉末，以碘化铋钾显色，呈阳性反应。ESI-MS m/z： 383 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.44（1H， s， 1-NH）， 7.47（1H， d，J=7.3 Hz， H-9）， 7.28（1H， s， H-17）， 7.17（1H， m， H-11）， 7.05（1H， t， J=7.1 Hz， H-10）， 6.89（1H， d，J=7.7 Hz， H-12）， 5.52（1H， m， H-19）， 4.94（2H， m， H-18）， 3.70（3H， s， OCH3）， 3.58（3H， s， COOCH3）， 3.31（1H， m， H-3）， 3.21（1H， d， J=10.9 Hz， H-15）， 2.07～1.97（2H， m， H-6a，6），1.08（1H， d，J= 11.4 Hz， H-14a）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 184.3（C-2）， 170.8（C-22）， 162.0（C-17）， 142.5（C-19）， 142.1（C-13）， 136.4（C-8）， 130.0（C-11）， 127.7（C-9）， 124.9（C-10）， 117.9（C-18）， 114.5（C-16）， 111.8（C-12）， 74.6（C-3）， 63.8（C-21）， 61.2（C-OCH3）， 59.3（C-7）， 56.5（C-5）， 53.5（C-COOCH3）， 45.0（C-20）， 40.1（C-15）， 38.0（C-6）， 32.1（C-14）。以上数据与文献（Kim et al.， 2011）对照基本一致，故鉴定该化合物为异去氢钩藤碱。

化合物4： 白色粉末，以碘化铋钾显色，呈阳性反应。ESI-MS m/z： 383 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.20（1H， s， 1-NH）， 7.27（1H， s， H-17）， 7.23（1H， d，J=2.8 Hz， H-9）， 7.04（1H， t，J=7.6 Hz， H-10）， 6.87（1H， d，J=7.7 Hz， H-12）， 5.51（1H， m， H-19）， 4.99～4.85（2H， m， H-18）， 3.73（3H， s， OCH3）， 3.62（3H， s， COOCH3）， 3.39（1H， t，J=6.8 Hz， H-3）， 3.28（1H， dd，J=10.8， 4.0 Hz， H-15）， 3.00（1H， m， H-20）， 2.07～1.98（2H， m， H-6a， 6b）， 1.90（1H， m， H-14b）， 1.24（1H， t，J=7.2 Hz， H-14a）. 13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 181.2（C-2）， 159.7（C-17）， 140.8（C-19）， 139.5（C-13）， 133.7（C-8）， 127.9（C-11）， 123.3（C-9）， 122.6（C-10）， 115.4（C-18）， 111.6（C-16）， 109.3（C-12）， 75.0（C-3）， 58.7（C-OCH3）， 56.6（C-7）， 54.8（C-5）， 51.2（C-COOCH3）， 42.6（C-20）， 34.7（C-6）， 28.8（C-14）。以上數据与文献（Chen et al.， 2009）对照基本一致，故鉴定该化合物为去氢钩藤碱。

化合物5： 棕色粉末，以碘化铋钾显色，呈阳性反应。ESI-MS m/z： 373 [M+Na]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 9.38（1H， s， H-21）， 8.02（1H， s， H-1）， 7.68（1H， s， H-17）， 7.49（1H， d，J=7.7 Hz， H-10）， 7.31（1H， d，J=7.9 Hz， H-11）， 7.20～7.09（2H， m， H-9， 12）， 6.68（1H， q，J=7.3 Hz， H-19）， 4.48（1H， d，J=11.5 Hz， H-3）， 4.02（1H， d，J=4.9 Hz， H-15）， 3.65（3H， s， OCH3）， 2.93（1H， m， H-6α）， 2.82（1H， d， H-6β）， 2.17（1H， d， H-14α）， 2.10（3H， d，J=7.5 Hz， H-18）， 1.93（1H， m， H-14β）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC：195.9（C-21）， 168.3（C-228）， 152.9（C-19）， 147.4（C-17）， 146.4（C-16）， 136.2（C-13），132.4（C-2）， 126.8（C-8）， 122.1（C-9）， 119.8（C-12）， 118.1（C-10）， 111.0（C-10）， 108.4（C-7）， 94.1（C-20）， 51.1（C-5）， 50.7（OCH3）， 49.3（C-3）， 34.1（C-14）， 28.3（C-15）， 22.0（C-6）， 15.1（q， C-18）。以上数据与文献（田丽娜等， 2014）对照基本一致，故鉴定该化合物为Vallesiachotamine。

化合物6： 白色粉末，以碘化铋钾显色，呈阳性反应。ESI-MS m/z： 393 [M + Na]+， 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.23（1H， s， NH-1）， 7.46（1H， s， H-9）， 7.18（1H， td，J=7.7， 1.2 Hz， H-11）， 7.04（1H， t，J=6.1 Hz， H-10）， 6.87（1H， d，J= 7.7 Hz， H-5a）， 3.35（1H， dd，J= 10.8， 3.6 Hz， H-12b）， 3.30（1H， dd，J= 8.4， 1.5 Hz， H-5b）， 0.83（1H， t，J=7.1 Hz， H-18）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC： 134.0（C-8）， 109.2（C-12）， 72.4（C-3）， 58.2（C-21）， 56.8（C-7）， 35.5（C-6）。以上数据与文献（Chou et al.， 2009）对照基本一致，故鉴定该化合物为异钩藤碱。

化合物7： 白色粉末，以碘化铋钾显色，呈阳性反应。ESI-MS m/z： 385 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.46（1H， s， NH-1）， 7.27（1H， s， H-9）， 7.17（1H， d，J=7.7 Hz， H-11）， 7.04（1H， t，J=7.5 Hz， H-10）， 6.90（1H， d，J=7.4 Hz， H-12）， 3.72（3H， s， OCH3）， 3.62（3H， s， COOCH3）， 2.44（1H， dd，J=17.1， 8.4 Hz， H-5a）， 2.02（1H， dd，J=12.6， 7.1Hz， H-6a）， 1.66（1H， t，J=10.4 Hz， H-21a）， 0.82（3H， t， J = 7.2Hz， H-18）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC： 181.5（C-2）， 159.8（C-17）， 140.9（C-13）， 133.8（C-8），127.7（C-11）， 123.1（C-10）， 109.3（C-12）， 58.2（C-21）， 56.0（C-7）， 55.0（C-5）， 37.8（C-15）， 34.8（C-6）， 31.9（C-14）， 24.2（C-19）， 11.3（C-18）。以上数据与文献（孙安盛等， 1995）对照基本一致，故鉴定该化合物为钩藤碱。

化合物8： 白色颗粒状结晶。1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 3.64（2H， dd，J=11.2， 6.4 Hz， CH2OH）， 1.56（2H， m， CH2CH2OH）， 1.27（50H， m）， 0.88（3H， t，J=7.0 Hz， CH3）。13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 63.1（C-1）， 32.8（C-2）， 31.9（C-26）， 29.7（C-3， 25）， 25.7（C-3）， 22.7（C-27）， 14.1（C-28）。以上数据与文献（蒋艳芳和徐慧， 2011）对照基本一致，故鉴定该化合物为二十八烷醇。

化合物9： 无色晶体。ESI-MS： m/z 415 [M + H]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 5.40（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）， 3.57（1H， m， H-3）， 1.06（3H， s， H-19）， 0.97（3H， d，J= 6.2Hz，H-21）， 0.73（3H， s， H-18）. 13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 140.8（C-5）， 121.7（C-6）， 71.8（C-3）， 56.1（C-14）， 56.1（C-17）， 50.1（C-9）， 42.3（C-4， 13）， 39.8（C-12）， 37.3（C-1）， 36.5（C-10）， 36.1（C-20）， 34.0（C-22）， 32.0（C-7）， 31.7（C-8）， 29.7（C-2）， 29.2（C-25）， 28.2（C-16）， 26.1（C-23）， 24.3（C-15）， 23.1（C-28）， 21.1（C-11）， 19.8（C-19）， 19.4（C-27）， 19.0（C-26），18.8（C-21）， 12.0（C-18， 29）。以上数据与文献（何康等， 2021）对照基本一致，故鉴定该化合物为β-谷甾醇。

化合物10： 白色无定形晶体。1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 2.39（2H， t，J=7.3Hz， 29-CH2）， 1.65（2H ， m，J= 4.8 Hz， 28-CH2）， 1.30（52H ， s， 2-27-CH2）， 0.93（3H， t， J= 6.3 Hz， -CH3）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 33.8（C-2）， 31.6（C-3）， 29.7（C-4-27）， 24.7（C-28）， 22.7（C-29）， 14.1（C-30）。以上数据与文献（张恒和饶坤林， 2016）对照基本一致，故鉴定该化合物为三十烷酸。

化合物11： 白色针晶。ESI-MS m/z： 353 [M - H]-， 1H-NMR（500 MHz， DMSO-d6） δC： 12.86（1H， s， 5-OH）， 6.68（1H， d，J=1.4 Hz， H-8）， 6.45（1H， d，J=1.4 Hz， H-6）， 6.29（1H， s， H-3）， 5.11（1H， d，J=5.1 Hz， H-1″）， 2.42（3H， s， CH3）。13 C-NMR（125 MHz， DMSO-d6） δC： 182.5（C-4）， 168.9（C-9）， 163.3（C-7）， 161.6（C-5）， 157.9（C-2）， 108.8（C-3）， 105.5（C-10）， 99.9（C-6）， 94.9（C-8）， 77.6（C-3′）， 76.8（C-5′）， 73.5（C-2′）， 70.0（C-4′）， 61.0（C-6′）。以上数据与文献（郭星和曾常青， 2010）对照基本一致，故鉴定该化合物为2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside。

化合物12： 白色粉末。ESI-MS m/z： 455 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 5.30（1H， t，J=3.5 Hz， H-12）， 3.24（1H， dd，J=11.3， 4.2 Hz， H-3）， 2.84（1H， dd，J=13.8， 4.2 Hz， H-18）， 1.15（3H， s）， 1.01（3H， s）， 0.95（3H， s）， 0.93（3H， s）， 0.92（3H， s）， 0.79（3H， s）， 0.77（3H， s）。 13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 183.2（C-28）， 143.6（C-13）， 122.6（C-12）， 79.1（C-3）， 55.2（C-5）， 47.6（C-9）， 46.5（C-17）， 45.9（C-19）， 41.6（C-14）， 41.0（C-18）， 39.3（C-8）， 38.8（C-4）， 38.4（C-1）， 37.1（C-10）， 33.8（C-21）， 33.1（C-7）， 32.6（C-22）， 32.4（C-29）， 30.7（C-20）， 28.1（C-23）， 27.7（C-15）， 27.2（C-2）， 26.0（C-27）， 23.6（C-11）， 23.4（C-30）， 22.9（C-16）， 18.3（C-6）， 17.1（C-26）， 15.6（C-24）， 15.3（C-25）。以上數据与文献（刘清华和葛尔宁， 2010）对照基本一致，故鉴定该化合物为齐墩果酸。

化合物13： 黄色粉末。ESI-MS m/z： 301 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 7.75（1H ， d，J=2.1 Hz， H-2′）， 7.65（1H， dd，J=8.5， 2.2 Hz， H-6′）， 6.90（1H， d，J=8.5 Hz， H-5′）， 6.41（1H， d， 2.1 Hz， H-8）， 6.19（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC： 175.9（C-4）， 164.2（C-7）， 161.1（C-5）， 156.8（C-9）， 147.4（C-2）， 146.6（C-4′）， 144.8（C-2′）， 135.8（C-3）， 122.7（C-1′）， 120.27（C-6′）， 114.82（C-5′）， 114.59（C-2′）， 103.11（C-10）， 97.83（C-6）， 93.01（C-8）。以上数据与文献（许彦， 2003）对照基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素。

化合物14： 白色粉末。ESI-MS m/z： 471 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） δH： 4.17（1H， d，J=4.9 Hz， H-3）， 3.07（1H， dd，J=10.3， 3.4 Hz， H-3）， 2.74（1H， dd，J=13.8， 4.1 Hz， H-18）， 1.10（3H， s， Me）， 0.72（3H， s， Me）， 0.53（3H， s， Me）。13 C-NMR（150 MHz， DMSO-d6） δC： 179.1（C-28）， 144.3（C-13）， 122.0（C-12）， 70.7（C-3）， 64.9（C-23）， 47.6（C-5）， 46.8（C-9）， 45.9（C-19）， 42.3（C-14）， 41.8（C-18）， 41.3（C-4）， 38.4（C-1）， 36.8（C-10）， 33.8（C-21）， 33.3（C-29）， 32.6（C-7）， 32.5（C-22）， 30.9（C-20）， 27.7（C-15）， 26.1（C-2）， 23.9（C-30）， 23.4（C-16）， 23.1（C-11）， 17.9（C-6）， 17.4（C-26）， 16.0（C-25）， 13.1（C-24）。以上数据与文献（刘小梅等， 2001）对照基本一致，故鉴定该化合物为常春藤苷元。

化合物15： 黄色粉末。ESI-MS m/z： 285 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH：8.10（2H， d，J=8.9 Hz， H-2′，6′）， 6.92（2H， d，J=8.9 Hz， H-3′， 5′）， 6.41（1H， d，J=2.1 Hz， H-8）， 6.20（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC：176.0（C-4）， 164.2（C-7）， 161.1（C-9）， 159.2（C-4′）， 156.9（C-5）， 146.6（C-2）， 135.7（C-3）， 129.3（C-2′， 6′）， 122.3（C-1′）， 114.9（C-2）， 103.1（C-10）， 97.9（C-6）， 93.1（C-8）。以上數据与文献（刘兴文等， 2003）对照基本一致，故鉴定该化合物为山柰酚。

化合物16： 白色固体。ESI-MS m/z： 247 [M + Na]+， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 5.84（1H， s， H-1）， 3.72（1H， dd，J=12.3， 6.2 Hz， H-9）， 2.48（1H， d，J=17.4 Hz， H-4a）， 2.07（3H， d，J= 1.1 Hz， H-13）， 2.03（1H， d，J=14.4 Hz， H-4b）， 1.98（1H， m， H-6）， 1.94（1H， m， H-7a）， 1.55（2H， m， H-8）， 1.46（1H， m， H-7b）， 1.19（3H， d，J=6.2Hz， H-10）， 1.12（3H， s， H-11）， 1.05（3H， s， H-12）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC： 200.8（C-3）， 168.3（C-5）， 124.0（C-4）， 67.2（C-2）， 51.0（C-6）， 46.7（C-2）， 38.4（C-8）， 35.9（C-1）， 27.6（C-12）， 26.1（C-11）， 25.8（C-7）， 23.5（C-13）， 22.2（C-10）。以上数据与文献（Wang et al.， 2018） 对照基本一致，故鉴定该化合物为（6R， 9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one。

化合物17： 白色粉末。ESI-MS m/z： 455 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） δH： 5.27（1H， s， H-12）， 3.08（1H， dd，J=11.7， 4.2 Hz， H-3）， 2.22（1H， d，J=10.9 Hz， H-18）。13 C-NMR（150 MHz， DMSO-d6） δC： 138.9（C-13）， 127.25（C-12）， 80.1（C-3）， 57.0（C-5）， 54.4（C-18）， 43.7（C-9， 7）， 40.7（C-14）， 40.6（C-8）， 40.4（C-4）， 39.9（C-19）， 38.2（C-1）， 31.8（C-7）， 30.7（C-21）， 29.2（C-10）， 28.5（C-15， 23）， 25.4（C-2）， 24.3（C-16）， 24.1（C-11）， 21.6（C-30）， 19.1（C-6）， 17.6（C-26）， 17.4（C-29）。以上数据与文献（薛梅等， 2004）对照基本一致，故鉴定该化合物为熊果酸。

化合物18： 白色粉末。ESI-MS m/z： 289 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 6.97（1H， d，J=1.5 Hz， H-2′）， 6.80（1H， dd，J=8.1， 1.5 Hz， H-5′）， 6.76（1H， d，J=8.1 Hz， H -6′）， 5.94（1H， d，J=2.2 Hz， H-8）， 5.92（1H， d，J=2.2 Hz， H-6）， 4.18（1H， s， H-3）， 2.86（1H， dd，J=16.7， 4.4 Hz， H-4）， 2.74（1H， dd，J=16.7， 2.4 Hz， H-4）。13C- NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 158.0（C-5）， 157.6（C-7）， 157.4（C-9）， l45.9（C-3′）， l45.7（C-4′）， 132.3（C-1′）， 119.4（C-6′）， 115.8（C-2′）， 115.3（C-5′）， l00.1（C-10）， 96.4（C-6）， 95.9（C-8）， 79.9（C-2）， 67.5（C-3）， 29.2（C-4）。以上数据与文献（徐东升等， 2015）对照基本一致，故鉴定该化合物为表儿茶素。

化合物19： 橙黄色粉末。ESI-MS m/z： 283 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 12.32（1H， s， 8-OH）， 12.13（1H， s， 1-OH）， 7.64（1H， s， H-4）， 7.38（1H， d， J=2.4 Hz， H-5）， 7.10（1H， s， H-2）， 6.70（1H， d， J=2.3 Hz， H-7）， 3.96（3H， s， OCH3）， 2.47（3H， s， CH3）。13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 190.8（C-9）， 182.0（C-10）， 166.5（C-1）， 165.2（C-8）， 162.5（C-3）， 148.4（C-6）， 135.2（C-4a）， 133.2（C-10a）， 124.5（C-7）， 121.3（C-5）， 113.7（C-9a）， 110.3（C-8a）， 108.2（C-2）， 106.8（C-4）， 56.1（OCH3）， 22.2（CH3）。以上数据与文献（Huang et al.， 2016）对照基本一致，故鉴定该化合物为大黄素甲醚。

2.2 抗肿瘤活性实验结果

化合物3和5对人白血病细胞HEL、K562的抗肿瘤活性实验结果如表1所示。结果表明，化合物3对人白血病细胞HEL有较强的抑制作用，其IC50值为17.96 μg·mL-1，然而对人白血病细胞K562没有抑制作用。化合物5对人白血病细胞K562的抑制作用较强，IC50值为16.45 μg·mL-1，对人白血病细胞HEL显示有较弱的抑制作用。

3 讨论与结论

贵州作为中国四大药材的主产区之一，其独特的地理环境和气候特征造就了丰富而独特的中药和民族藥资源，贵州民族道地药材钩藤是抗肿瘤的重要药材，虽然钩藤入药部位为带钩茎枝，但是其占整个药材的比例较低，资源浪费较为严重。近来研究显示，钩藤非药用部位的化学成分与药用部位成分相似，课题组前期利用HPLC测定了黔产钩藤不同药用部位钩藤碱和异钩藤碱的含量。基于前期基础，本研究对钩藤非药用部位茎和叶进行化学成分的分离和纯化，从中分离得到19个化合物，运用核磁、质谱等波谱技术进行了结构鉴定，其中，化合物 1， 8， 10， 16 均为首次从钩藤植物中分离得到。同时，采用MTT法对化合物3和5进行了抗肿瘤活性筛选，实验结果显示，化合物3对人白血病细胞HEL有较强的抑制作用，其IC50值为17.96 μg·mL-1，然而其对人白血病细胞K562并无抑制作用。化合物5对人白血病细胞K562的抑制作用较强，IC50值为16.45 μg·mL-1，对人白血病细胞HEL具有较弱的抑制作用。尽管化合物3和5对人白血病细胞株K562和HEL 2株癌细胞的增殖抑制作用比阳性对照紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂和5-氟尿嘧啶的抑制作用弱，但从一定角度上表明，钩藤中生物碱类化合物具有抗肿瘤活性，为后续钩藤生物碱类化合物的分离以及活性筛选提供思路。

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（责任编辑 李 莉）