Box-Behnken响应面法优化余甘子总多酚超声提取工艺

林长彬 赵旭珠 李晚谊 于丽娟 陈建 李宏 夏陈 邓俊琳 李智敏

摘 要：以余甘子中总多酚的提取量为评价指标，通过单因素试验结合Box-Behnken响应面法，研究乙醇浓度、超声时间、超声温度对余甘子中总多酚提取工艺的影响，并优化提取工艺。结果表明：影响余甘子总多酚提取的因素主次为乙醇浓度>超声温度>超声时间，最佳提取工艺为乙醇浓度64%、超声时间39 min、提取温度43 ℃。验证试验中总多酚提取量为186.17 mg/g，与模型预测值190.33 mg/g较接近。Box-Behnken响应面回归方程拟合度良好，适合用于余甘子总多酚提取工艺的回归分析和参数优化。

关键词：余甘子;总多酚;Box-Behnken响应面法;超声提取

余甘子在我国主要分布于广西、云南、贵州等地区[1-2]，被列为“药食两用”原料。余甘子含有丰富的多酚、超氧化物歧化酶（SOD）、多糖、维生素、氨基酸、黄酮等活性成分[3-4]，具有保肝、降压、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗炎镇痛等功效[5-7]，药用和食用价值较高[8-9]。研究表明，余甘子抗氧化性是其生理功能的基础，而余甘子多酚是主要的抗氧化物质[10]。目前已有大量的研究对余甘子中多酚提取进行了研究。杨冰鑫等[11]通过正交试验优化了余甘子中总多酚的提取工艺为提取时间135 min、浸提温度70 ℃、乙醇浓度45%。曹雄等[12]利用正交设计对余甘子多酚提取进行工艺筛选，确定最佳提取工艺为50%甲醇、料液比1∶10、提取次数1次、浸提时间90 min。吴丹玲等[13]研究不同浓度的丙酮、甲醇、乙醇提取溶剂对余甘子中多酚提取的影响，发现70%丙酮提取3次为最佳工艺。虽然目前对余甘子中总多酚的提取工艺进行了大量的优化研究，但鲜有研究利用响应面对超声辅助提取余甘子中总多酚工艺进行优化。本试验研究乙醇浓度、超声时间、超声温度等3个工艺参数对余甘子总多酚提取量的影响，并用响应面法优化余甘子总多酚超声辅助提取工艺，为余甘子產品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料

余甘子，2018年3月采收于云南省大理市宾川县，挑选出新鲜无损的余甘子果，于100 ℃干燥20 min后80 ℃烘干（干燥过程中每隔1 h称重，当相隔2次重量之差≤2%时即认定为已烘干），样品经粉碎、过60目筛密封装袋备用。

1.2 试剂与仪器

福林酚、没食子酸、乙醇等，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。Synergy HTX酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;FW-100高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司;TD-4Z型台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司;KH2200DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总多酚提取 称取1.00 g余甘子粉末，加入8 mL 80%乙醇溶液，40 ℃超声提取40 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，此为待测液。

1.3.2 单因素试验

（1）乙醇浓度对总多酚提取的影响：称取1.00 g余甘子粉末分别加入15 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液，40 ℃超声提取40 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，测定其多酚含量。

（2）超声时间对总多酚提取的影响：称取1.00 g余甘子粉末加入15 mL 80%乙醇溶液，分别40 ℃超声提取20、30、40、50、60 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，测定其多酚含量。

（3）超声温度对总多酚提取的影响：称取1.00 g余甘子粉末加入15 mL 80%乙醇溶液，分别用30、40、50、60、70 ℃超声提取40 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复提取2次，合并3次上清液并定容到25 mL，测定其多酚含量。

1.3.3 响应面设计试验 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理，以时间（A）、温度（B）、乙醇浓度（C）为自变量，以余甘子总多酚提取量为响应值，设计三因素三水平表（表1）。

1.3.4 总多酚的检测 参照Chu等[14]方法略做修改，取10 μL待测液于96孔板中，加入20 μL福林酚，放置反应5 min，再加入160 μL 5%碳酸钠溶液，避光反应1 h，用酶标仪在765 nm处测定吸光值，每个样品重复3次，取平均值。以没食子酸质量浓度为136.25、68.125、34.062、17.031、8.516、4.258、2.129、1.064 μg/mL为横坐标（X），以吸光值为0.599、0.334、0.194、0.115、0.075、0.061、0.05、0.049为纵坐标（Y）绘制标准曲线得回归方程：Y=0.004X+0.045（R2=0.999）。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对余甘子总多酚提取量的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，总多酚提取量在乙醇浓度为20%时含量较高，为155.37 mg/g，之后随着浓度增加提取量反而下降，40%时提取量降至最低，继续增加乙醇浓度，提取量逐渐增加，当乙醇浓度为80%时，提取量达到最大172.85 mg/g，此后又明显降低。当20%乙醇作溶剂时，提取液中可能含有大量的水溶性多酚，随着溶剂浓度增加，水溶性多酚的溶出逐渐减少。由于多酚类物质在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形成稳定的复合物，各物质之间的氢键和疏水键在低浓度条件下很难被破坏[15]，因此乙醇浓度为40%和60%时总多酚含量相对较低;当浓度在60%～80%时，由于氢键和疏水键等被破坏，提高多酚类物质的溶出，使得总多酚提取量迅速增加;当乙醇浓度超过80%，水分含量逐渐减少，部分水溶性多酚不能充分溶解，而其他脂溶性成分浸出率较高，对多酚类物质的提取不利[16]。因此，80%乙醇溶液作为余甘子总多酚的提取溶剂将进一步优化。

2.2 超声时间对余甘子总多酚提取量的影响

由图2可知，随着超声时间的延长，总多酚提取量先增大后减小，时间为30 min时，提取量达最大（184.78 mg/g），这可能是由于延长超声时间，增大了总多酚溶出，当细胞中有效成分基本全部溶出时，提取量将不再增加。随着时间继续延长，总多酚提取量明显下降，这可能与余甘子中多酚类化合物的稳定性差有关，超声时间过长增大氧化变形发生的可能使得多酚类化合物结构遭到破坏从而使得多酚提取量下降。因此，超声时间30 min将进行进一步优化。甘瑾等[17]也发现，随着提取时间的延长，余甘子中多酚的提取量反而显著降低。

2.3 超声温度对余甘子总多酚提取量的影响

由图3可见，随着提取温度的升高，总多酚提取量逐渐增加，当提取温度到达50 ℃时，提取量达最大值191.62 mg/g，温度升高能够增加溶剂分子和溶质分子的运动促进扩散，增加提取物的溶解度和扩散系数，利于多酚类化合物的溶出;但温度继续升高至60 ℃时，总多酚提取量明显下降，可能由于温度过高降低了溶剂的黏度，从而引起多酚化合物的降解而导致提取量下降[18]。

2.4 响应面结果分析

2.4.1 回归模型方程的建立 结合单因素，响应面试验的设计及结果见表2，采用Design expert 8.0软件对所得数据进行多元回归拟合，得到余甘子中总多酚提取率（Y）对超声时间（A）、超声温度（B）和乙醇浓度（C）的回归方程：

Y=169.90+0.22A-14.20B-28.30C-9.50AB+4.96AC+19.35BC+4.03A2-33.84B2-15.20C2。

2.4.2 模型及回归方程系数的显著性检验 对该模型进行方差分析，表3结果表明，模型极显著（P<0.01），失擬项为1.32，P=0.385 4>0.05，差异不显著，说明该模型可用于余甘子总多酚提取试验的预测，试验方案可行[19]。此外该模型的变异系数为10.48%，为测试结果接受范围内。结果表明，C和B2对余甘子中多酚提取的影响极显著，B和BC对余甘子中多酚提取的影响显著，而其他系数均不显著影响。在所选取的各影响因素水平范围内，按照对余甘子多酚提取的影响排序为C（乙醇浓度）>B（超声温度）>A（超声时间）。

2.4.3 总多酚提取的响应面分析 根据回归模型所得响应面曲线图和等高线图，分析各因素的交互作用，其中仅乙醇浓度和超声温度的交互作用是显著。等高线的形状可以反映出交互作用的强弱，椭圆形表明交互作用显著，而圆形则与之相反。通过方差分析及响应面分析可知，乙醇浓度是影响余甘子总多酚提取量的主要因素，超声温度次之，超声时间影响最小。并通过软件分析计算得出超声提取总多酚的最佳理论提取值，同时余甘子总多酚最佳工艺条件为乙醇浓度64.37%、时间39.22 min、温度42.93 ℃。考虑到试验条件的可操作性，将工艺参数调整为乙醇浓度64%、时间39 min、温度43 ℃，在此条件下，预测余甘子总多酚提取量达190.33 mg/g。为了验证预测值，在最优提取条件下进行验证试验，计算得到余甘子总多酚的提取量为186.17 mg/g，与预测值相差2.18%，表明建立的模型可以较好地模拟和预测余甘子总多酚的提取效果（图4）。

3 结论

以余甘子为原料，利用超声辅助提取总多酚，通过响应面试验优化工艺发现影响余甘子多酚提取的因素主次为C（乙醇浓度）>B（超声温度）>A（超声时间），并得到余甘子最优工艺参数为乙醇浓度64%、时间39 min、温度43 ℃，在此条件下验证余甘子总多酚提取量为186.17 mg/g，证明了响应面法优化超声提取余甘子总多酚最优工艺可行。◇

参考文献

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Ultrasonic Extraction of Total Polyphenols from Phyllanthus emblica Fruit by Box-Behnken Response Surface Method

LIN Chang-bin1，ZHAO Xu-zhu1，LI Wan-yi2，YU Li-juan3，CHEN Jian1，LI Hong3，XIA Chen1，DENG Jun-lin1，LI Zhi-min2

（1Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China;2Medicinal Plants Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China;3Agro-products Processing Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650221，China）

Abstract：Taking the extraction yield of total polyphenols in Phyllanthus emblica as an indicator， we investigated the effects of factors as ethanol concentration， ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus emblica and obtained the optimal extraction process conditions through the single factor test combined with Box-Behnken Response Surface Method. The results showed that the order of factors affecting the extraction yield of total polyphenols of Phyllanthus emblica was ethanol concentration > ultrasound temperature > ultrasound time. The optimal extraction conditions were ethanol concentration 64%， ultrasonic time 39 min， and extraction temperature 43 ℃. The verified test proved that the extraction yield of total polyphenols was 186.17 mg/g， which was closed to the model predicted value of 190.33 mg/g. The regression equation of response surface had a good fit and was suitable for regression analysis and parameter optimization of the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus emblica.

Keywords：Phyllanthus emblica;total polyphenol;Box-Behnken Response Surface Method;ultrasonic extraction