花生肽对小鼠的抗疲劳作用研究

于晓晨 李臻 胡佳妮 刘欣然 刘睿 郝云涛 康家伟 珠娜 李勇

摘 要：目的：探讨花生肽对ICR小鼠的抗疲劳作用。方法：采用SPF级雄性ICR小鼠80只按体重随机分为4组，分别为空白对照组、3个花生肽干预组（250、500、1 000 mg/kg BW]。每日经口灌胃给予受试样品水溶液，干预周期为30 d，干预结束后进行负重游泳试验，并对各组小鼠负重游泳力竭时间进行记录，同时对其血糖水平、血清尿素氮含量及乳酸脱氢酶活力进行测定，并检测各组小鼠血乳酸水平，检测各组小鼠肝、肌糖原含量，并测定小鼠血清生化指标，同时测定小鼠心肌、肝脏及腓肠肌氧化应激和脂质过氧化指标水平。结果：与空白对照组相比，花生肽可显著延长小鼠负重游泳力竭时间，并提高其乳酸脱氢酶活性，降低运动后小鼠血乳酸含量，加强肌糖原储备，提高心肌SOD活力。结论：花生肽具备一定的抗疲劳作用。

关键词：花生肽;抗疲劳;小鼠负重游泳

疲劳可根据其状态分为继发性疲劳、生理性疲劳及慢性疲劳三种，而慢性疲劳是指持续时间超过6个月的主观疲劳状态，通常伴有持续的肌肉疼痛、认知障碍及睡眠障碍[1-2]，目前病因尚不清楚。伴随着现代社会的进步，广泛存在的社会竞争及快节奏的生活使得疲劳相关综合征成为了严重的全球性健康问题，在美国饱受持续性疲劳困扰的男性达到2.3%，女性则为1.9%[3]。一项针对苏州市中学生的调查发现，受到长期疲劳症状困扰的则达到了0.9%[4]。除此以外，疲劳还是多种疾病的相关并发症。疲劳相关的病理生理及病因尚未被完全解析，目前针对疲劳相关症状的缓解药物种类有限，且存在副作用[5]，因此寻求具有抗疲劳作用的功能性食品来代替药品进行缓解疲劳相关干预具有重要意义。

花生是世界范围内普遍使用的油料作物，在中国已有数百年的种植史，产量居世界首位，是重要的经济作物。近年来，花生因其富含人类生长发育所需要的营养物质而越来越被推崇为营养膳食，研究称其含有蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素E、维生素B族、大量矿物质及植物营养素（白藜芦醇、异黄酮类、酚酸、植物甾醇等），对促进机体健康有良好的应用前景[6]。其中，花生蛋白成为了近些年的研究热点，其蛋白质含量可高达25%～30%，其中含有18种氨基酸，包括机体不能自身合成的8种必需氨基酸，其中苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸含量相对较高[7]。目前，花生蛋白已作为食品的主要成分及辅料应用于日常食品之中，如花生蛋白乳制饮品、花生蛋白粉等。

生物活性肽是指通过生物酶解技术从蛋白质中获取的不完全分解产物，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，较蛋白质吸收率高，且具备代谢效率高、安全性高、不易过敏等特点[8]。花生肽是指从花生蛋白中酶解提取的小分子肽，作为天然的活性肽，具有多种生物活性，如降血压[9]、抗氧化[10]、抑菌[11]等。但目前关于花生肽抗疲劳及相关的机制研究文献报道较少，本研究应用不同剂量的花生肽对小鼠进行灌胃干预，通过负重力竭游泳实验评价其干预运动继发性疲劳的作用并探讨花生肽缓解疲劳的可能机制，为研发花生肽作为临床辅助改善疲劳的功能性食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生肽，淡黄色固体粉末，购自武汉天天好生物制品有限公司，主要成分为分子量小于2 000的低聚肽，高達80%;健康SPF级雄性ICR小鼠80只，18～22 g，由北京大学医学部实验动物中心提供（实验动物许可证号：SYXK（京）2011-0039;实验动物生产许可证号：SCXK（京）2011-0012）。

紫外分光光度计，UV-2000（UNIC）;全自动生化仪，AU480贝克曼（美国）;肝糖原/肌糖原检测试剂盒，南京建成生物科技;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）检测试剂盒，南京建成生物科技。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 小鼠饲养在北京大学医学部实验动物科学部，实验期间自由饮食、饮水。适应性喂养1 w后，根据体重将小鼠随机分为4组，每组20只：1个空白对照组、3个花生肽干预组（250、510、1 000 mg/kg·BW）。每日以0.1 mL/10 g BW灌胃量经口干预，花生肽干预组给予相应浓度受试物，花生肽使用蒸馏水配置，空白对照组给予等体积灭菌蒸馏水。实验期间小鼠每周称重1次，依体重调整受试样品的剂量，并每日观察小鼠的一般情况。干预持续30 d后，将每组小鼠随机分为A和B 2个亚组。A亚组小鼠进行不负重游泳相关血乳酸水平检测，7 d后进行血糖及血清尿素氮水平、乳酸脱氢酶活力及肝脏、心肌、腓肠肌氧化应激指标的测定;B亚组小鼠为负重游泳实验，并检测肝糖原及肌糖原含量。

1.2.2 血乳酸测定 A亚组小鼠鼠尾取血20 μL，后再置于30 ℃的水中，进行不负重游泳10 min，并于游泳结束第0 min及游泳后20 min分别采血20 μL。将游泳前、游泳后0 min、游泳后20 min采得的血样分别加入0.48 mL质量分数为1%的NaF溶液中，充分混匀至透明后加入1.5 mL蛋白沉淀剂，再次振荡混匀，在4 ℃ 3 000  r/min离心10 min吸取上清，采用对羟基联苯比色法测定各组小鼠血乳酸含量。

1.2.3 血清尿素氮和乳酸脱氢酶、血糖水平及氧化应激指标的测定 A亚组小鼠，置于30 ℃的水中进行持续90 min的不负重游泳，游泳结束后休息60 min进行眼球采血，并使用颈椎脱臼法处死小鼠，分离肝脏、心脏及左腿腓肠肌备用。血液于4 ℃冰箱放置3 h待凝固，2 000 r/min离心15 min，分离血清，采用全自动生化仪测定血糖、血清乳酸脱氢酶及血清尿素氮水平，并根据试剂盒说明书进行氧化应激指标（肝脏、左腿腓肠肌及心肌的SOD、GSH-PX、MDA水平）的测定。

1.2.4 负重游泳试验 B亚组小鼠，在水温为（25±1.0）℃、水深为30 cm的游泳箱 （长宽高约为50 cm* 50 cm*40 cm）中进行负重游泳，鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至力竭死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。

1.2.5 肝糖原和肌糖原测定 B亚组负重游泳结束后颈椎脱臼法处死小鼠，分离新鲜肝脏及左腿腓肠肌组织，用生理盐水漂洗组织至无血色，滤纸吸干，按试剂盒说明书进行肝糖原及肌糖原水平的检测。

1.3 统计方法

正态及非正态分布的连续变量分别以平均数±标准差表示;分类变量以个数（百分数）表示。采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行两组间比较;方差不齐时采用Tamhane和Dunnett法进行post-hoc分析。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 花生肽对小鼠血乳酸含量的影响

取A亚组40只小鼠，分别测定小鼠不负重游泳前、游泳后0 min及游泳后20 min血乳酸水平。如表1所示，游泳前，各组小鼠血乳酸含量水平无显著性差异;游泳后20 min，与空白对照组相比，花生肽低、中、高剂量组血乳酸含量均显著降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;与空白对照组相比，花生肽低、中、高剂量组小鼠血乳酸曲线下面积显著降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.2 花生肽对小鼠血清尿素氮、乳酸脱氢酶活性和血糖的影响

如表2所示，与空白对照组相比，花生肽低、中、高剂量组小鼠血糖含量均显著提高（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;花生肽低剂量组小鼠乳酸脱氢酶活性高于空白对照组（P<0.01）;各组小鼠血清尿素氮水平相比较无显著性差异（P>0.05）。

2.3 花生肽对小鼠负重游泳时间的影响

如附图所示，花生肽低、高剂量组小鼠负重游泳时间比空白对照组显著延长（P<0.05、P<0.05）。

2.4 花生肽对小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响

如表3所示，与空白对照组相比，花生肽高剂量组小鼠肌糖原含量显著升高（P<0.05），各组肝糖原水平无显著性差异（P>0.05）。

2.5 花生肽对小鼠抗氧化相关指标的影响

如表4所示，与空白对照组相比，花生肽中、高剂量组小鼠心肌组织中SOD活力明显升高（P<0.01、P<0.01）;其余抗氧化相關指标各组间无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

运动继发性疲劳是指在长时间运动后机体出现的主观不适感，是机体内生理机能水平下降及组织器官维持机体运转能力降低的体现，这个过程与能量代谢、代谢产物累积、内分泌及代谢功能的紊乱密切相关[12]。运动耐力是评价抗疲劳作用的重要指标，而负重游泳实验是常用的抗疲劳耐力运动模型，研究发现其实验中动物的力竭游泳时间可以反映动物的疲劳状况，并对其耐力进行评价[13]。本研究结果显示，花生肽干预可以显著延长小鼠负重力竭游泳时间，说明其具有抗疲劳作用。

高强度的运动伴随着能量的大量消耗，这使得糖酵解成为其必需能量来源。血乳酸是碳水化合物在无氧条件下糖酵解的主要产物，在机体内过量时会诱发肌肉局部疼痛及酸胀感，并影响体内生长激素水平产生疲劳[14]，因此血乳酸是判断机体运动强度及疲劳程度的重要指标，其代表了机体运动前后的疲劳程度及恢复情况[15]。乳酸脱氢酶在丙酮酸及乳酸之间的氧化还原反应中发挥了重要作用，是糖酵解中的关键酶，当过量运动机体乳酸水平过高时，机体可以利用乳酸脱氢酶将乳酸氧化为丙酮酸进行去除，从而缓解乳酸累积对机体造成的损害[16]。另外，高强度运动可引起机体蛋白质降解，诱发尿素氮生成的增加，这使得尿素氮水平成为反应机能、疲劳程度及负荷量的重要指标[17]。本研究显示，花生肽干预能够显著改善小鼠游泳后乳酸脱氢酶水平，并一定程度上减少血乳酸产生，降低血乳酸曲线下面积，具有改善疲劳程度效果。本研究中未见花生肽对小鼠游泳后血清尿素氮水平的显著改变，关于其能否通过干预蛋白质代谢来降低机体疲劳程度有待进一步探讨。

糖是机体重要的能源物质，运动伴随着糖分解代谢的增强。运动的能量最初来自糖原的分解，在肌糖原被消耗殆尽后，肝糖原被动员用于补充能量代谢。因此增强糖原储备，并减缓力竭运动时糖原的利用，有助于加强机体缓解疲劳的能力并提升运动耐力[18]。本研究中，与空白对照组相比，花生肽低、中、高剂量组小鼠游泳后血糖水平均显著提升，且花生肽高剂量组肌糖原水平显著高于空白对照组，这说明花生肽可通过提高肌糖原储备，减缓游泳时小鼠糖原消耗，并维持机体血糖水平，达到抗疲劳作用。

过量的运动过程伴随着超氧阴离子自由基的生成及积累，这会导致机体氧化应激，而自由基堆积后会与大分子DNA、蛋白质及脂质成分间发生生物反应，致使过氧化物生成，破坏细胞分子结构，进而与多种疾病的发生发展产生联系。近期研究表明，机体内源性抗氧化水平及脂质过氧化物MDA的累积水平，也可说明机体的抗运动疲劳能力[19]。SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶，本研究测定了小鼠游泳后心肌、肝脏及腓肠肌中SOD、GSH-Px活力及MDA的水平，结果显示，与空白对照组相比，仅有心肌组织中表现出了花生肽中、高剂量组小鼠SOD活力的升高，关于肝脏、腓肠肌及其GSH-Px活力及MDA水平并无显著性变化，关于花生肽的抗氧化防御能力仍需根据进一步研究进行探讨。

4 结论

综上所述，花生肽能够延长小鼠负重游泳时间，具有显著的抗疲劳效用，其作用机制可能与提高小鼠肌糖原储备，改善运动中血糖水平，提高乳酸脱氢酶活性，降低血乳酸水平，并一定程度上改善机体抗氧化活性相关。本研究为花生肽的开发利用提供科学依据。◇

参考文献

[1]Huang C C，Hsu M C，Huang W C，et al.Triterpenoid-rich extract from antrodia camphorata improves physical fatigue and exercise performance in mice[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012，2012：364741.

[2]Ali S，Adamczyk L，Burgess M，et al.Psychological and demographic factors associated with fatigue and social adjustment in young people with severe chronic fatigue syndrome/myalgic encephalomyelitis：a preliminary mixed-methods study[J]. Journal of Behavioral Medicine，2019，42（5）：898-910.

[3]Baraniuk J N .Chronic fatigue syndrome prevalence is grossly overestimated using Oxford criteria compared to centers for sisease control （Fukuda）criteria in a U.S.population study[J]. Fatigue，2017，5（4）：215-230.

[4]Shi J，et al.Chronic fatigue syndrome in Chinese middle-school students[J].Medicine，2018，97（4）：e9716.

[5]Zheng Y，Zhang W C，Wu Z Y，et al.Two macamide extracts relieve physical fatigue by attenuating muscle damage in mice[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2019，99（3）：1405-1412.

[6]Toomer O T .Nutritional chemistry of the peanut （Arachis hypogaea）[J]. C R C Critical Reviews in Food Technology，2018，58（17）：3042-3053.

[7]魏紅艳，卞科.花生蛋白的研究与开发[J].农产品加工（创新版），2010（5）：46-51.

[8]李勇.肽营养学[M]. 北京：北京大学医学出版社，2007.

[9]Jamdar S N，Rajalakshmi V，M.D.Pednekar，et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties，antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J]. Food Chemistry，2010，121（1）：178-184.

[10]刘英丽，张慧娟，王静，等.酶解花生粕制备抗氧化肽工艺研究[J].中国食品学报，2014，14（8）：62-68.

[11]陈彤，王常青，白云云，等.花生饼粕酶解多肽抑菌作用的研究[J].农产品加工，2015（7）：23-25.

[12]闫曙光，等.黄芪建中汤抗疲劳机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2020，22（3）：799-803.

[13]Tanaka M.Establishment and assessment of a rat model of fatigue[J]. Neuroence Letters，2003，352（3）：159-162.

[14]王猛，颜克亮，杨莹，等.东紫苏提取物抗疲劳及抗氧化作用的研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2020，22（5）：1641-1647.

[15]Wang J J，Shieh M J，Kuo S L，et al.Effect of red mold rice on antifatigue and exercise-related changes in lipid peroxidation in endurance exercise[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，2006，70（2）：247-253.

[16]Adeva-Andany M，López-Ojén M，Funcasta-Calderón R，et al.Comprehensive review on lactate metabolism in human health[J]. Mitochondrion，2014，17：76-100.

[17]Yue Z，Wen C Z，Ze Y W，et al.Two macamide extracts relieve physical fatigue by attenuating muscle damage in mice[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2019，99（3）：1405-1412.

[18]Li J，Sun Q，Meng Q，et al.Anti-fatigue activity of polysaccharide fractions from Lepidium meyenii Walp.（maca）[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2017，95：1305-1311.

[19]邱娟.核桃清蛋白抗氧化肽对力竭运动小鼠抗疲劳和抗氧化能力的影响[J].基因组学与应用生物学，2020，39（5）：2222-2229.

Anti-fatigue Effect of Peanut Peptide on Mice

YU Xiao-chen，LI Zhen，HU Jia-ni，LIU Xin-ran，LIU Rui，HAO Yun-tao，KANG Jia-wei，ZHU Na，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the anti-fatigue effect of peanut peptide on ICR mice.Method A total of 80 specific pathogen free （SPF）male ICR mice were randomly divided into 4 groups according to body weight，which were blank control group and 3 peanut peptide intervention groups（250，500，1 000 mg/kg BW）.The test samples and lipid peroxidation index were given by oral gavage every day，and the intervention period was 30 days.After the intervention，the weight-bearing swimming test was carried out and the exhaustion time of each group was recorded.The blood glucose level，serum urea nitrogen content and lactate dehydrogenase activity of mice were detected.Blood lactic acid level，liver and muscle glycogen content of mice in each group were also determined，and the serum biochemical indexes were determined.Oxidative stress level of myocardium，liver and gastrocnemius and lipid peroxidation index were also measured.Result Compared with the blank control group，peanut peptide could significantly prolong the weight-bearing swimming time，increase lactate dehydrogenase activity，reduce blood lactic acid content，increase muscle glycogen reserves，increase myocardial SOD activity.Conclusion Peanut peptide has certain effect of anti-fatigue.

Keywords：peanut peptide;anti-fatigue;weight-bearing swimming test