响应面Box—Behnken设计优化超声提取桑椹多酚条件

韦丽文 陈振建

【摘要】 目的：利用响应面Box-Behnken设计优化超声提取桑椹多酚工艺条件。方法：选择乙醇浓度、桑椹粉碎度、料液比、提取时间4个因素进行单因素考察，在此基础上，用响应面Box-Behnken设计对影响较大的单因素进行3因素3水平响应面分析，以确定最佳提取条件。结果：桑椹多酚类化合物的最佳提取工艺为乙醇浓度为44.6%、桑椹粉碎度为120目、料液比为1∶34（g/ml）。结论：响应面Box-Behnken设计能优化超声提取桑椹多酚提取条件，提高桑椹多酚提取得率。

【关键词】 响应面法；Box-Behnken设计；超声提取；桑椹多酚

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）10-0025-03

Optimization of the parameters on extraction of Polyphenol from Mori Fructus with ultrasonic wave technology by Box-Behnken design-response surface method

WEI Liwen1CHEN Zhenjian2

1.Guangxi university of Chinese medicine，Guangxi Nanning 530001；2. The pepole′s hospital of Guangxi Lingshan county，Guangxi Lingshan 535400

Abstract：Objective To optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus by the response surface method. Method Base on ethanol concentration， comminution degree， the liquid-solid ratio， ultrasonic time of single factor experiment， the BoxBehnken design for 3 star factor 3 level response surface methodology was applied， to ascertain the best extraction condition. Results The ethanol concentration of 44.6%， comminution degree of 120 section and liquid-solid ratio of 34.1∶1 were selected as the optimum conditions. Conclusion Box-Behnken design of response surface methodology was applied to optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus

Keywords：the response surface method；Box-Behnken；ultrasonic extraction； polyphenol of Mori Fructus

桑椹Mori Fructus为桑科植物桑（Morus alba L.）的果实，为药食两用之佳品，具有滋阴补血、生津润燥的功效，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、心悸失眠、须发早白、津伤口渴、内热消渴、肠燥便秘[1]。《本草纲目》记载“椹有乌、白二种”。《四时月令》云“四月宜饮桑椹酒，能理百种风热。”《本草新编》有云“四月采桑椹数斗，饭锅蒸熟晒干即可为末”。多酚广泛存在于植物体中，也是桑椹中的主要成分，其主要包括黄酮类、棓酸类及黄烷醇类等，具有抗氧化、抗菌、防癌抗癌等作用[2-4]。超声广泛用于有效成分提取，其可加速成分进入溶剂，保持被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变，极大提高提取效率[5]。Box-Behnken设计是用来评价因素指标和因素间非线性关系的一种试验设计方法，具有试验次数相对较少，评价准确的优点，广泛用于中药有效成分的提取条件优化。本文在单因素实验的基础上，运用响应面Box-Behnken设计优化超声提取桑椹多酚条件，为今后桑椹多酚资源更好地利用垫定了基础。

1仪器与材料

1.1仪器粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；岛津UV-1800紫外分光光度计；Elmasonic P300H超声清洗器；梅特勒-托利多电子分析天平。

1.2试剂与材料桑椹采于广西蚕业推广总站，经广西蚕业技术推广总站朱方容研究院鉴定为桑科植物广东桑Morus atropurpurea Roxb.的果穗。没食子酸（天津市光复精细化工研究所）、乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、Na2CO3（天津博迪化工股份有限公司）、福林酚试剂（上海荔达生物科技有限公司）均为分析纯。

2方法

2.1桑椹药材处理将采回的桑椹用沸水蒸1min后置于鼓风干燥箱，55℃烘干，打粉，过筛。

2.2桑椹多酚测定方法桑椹多酚测定方法参照李巨秀[6]多酚测定方法，在此基础上稍作改进。

2.2.1没食子酸标准溶液配制取没食子酸标准品适量，精密称定为0.0020g，用纯水溶解并定溶于100ml容量瓶，得质量分数为20mg/L的对照品标准液。

2.2.2最佳测定波长的确定用移液枪吸取1.0ml的没食子酸标准溶液和桑椹多酚提取液分别置于10ml的容量瓶中，分别加入1mol/l 福林酚试剂1ml，混匀，加入2ml质量浓度为0.15g/ml Na2CO3溶液，充分混匀后定容，室温避光放置80min后进行紫外全波长（200～800）光谱扫描，并设试剂空白对照，最终确定760nm为最大吸收波长。

2.2.3没食子酸标准曲线绘制准确吸取没食子酸标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml于10ml容量瓶中，分别加入1mol/l 福林酚试剂1ml，混匀，再加入0.15g/ml Na2CO3溶液2ml，充分混匀后定容，配成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L没食子酸样品溶液，室温避光放置80min。以不加标准液的溶液为空白对照，在760nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为橫坐标，绘制标准曲线为A=0.0953X+0.0675（r=0.9989），表明在2～12mg/L范围内线性关系较好。

2.3超声提取单因素实验选取乙醇溶度、桑椹粉碎度、料液比、超声时间4个因素作单因素实验，进行超声提取后取1ml粗提液用2.2下方法测其吸光度，带入回归方程中计算多酚浓度（mg/l），从而得到多酚提取质量。

2.4Box-Behnken响应面设计在单因素实验的基础上选取对桑椹多酚提取率影响较大的乙醇浓度（%）、桑椹粉碎度（目）、料液比（g/ml）三个因素三水平为自变量进行Box-Behnken实验设计。多酚提取质量（mg）为因变量，选取的三因素分别编码为乙醇浓度A、粉碎度B、料液比C，三水平分别用-1、0、1表示，编码因素及水平见表1。

表1Box-Behnken设计因素水平表

编码因素

水平

-101

A乙醇浓度/ %405060

B粉碎度/目80100120

C料液比1∶20 1∶301∶40

3结果与分析

3.1单因素实验

3.1.1乙醇浓度对多酚提取质量的影响称取桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，分别加入浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液10ml，超声提取30min，提取温度60℃，4000r离心，取上清液，测多酚含量。结果桑椹多酚提取质量随着乙醇浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当乙醇浓度为40%时多酚提取质量达到最高，因此最佳的乙醇浓度为40%，如图1所示。但考虑到有机溶剂对多酚提取能起到氢键断裂作用（有机溶剂所占比例最佳为50%～70%）[7]。因此选取40%、50%、60%，三水平再做响应面分析。

3.1.2粉碎度对多酚提取质量的影响分别称取过3号50目、4号65目、5号80目、6号100目、7号120目筛的桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，加入50%乙醇10ml，超声提取30min，提取温度60℃度，4000r离心，取上清液，测定多酚含量，结果桑椹多酚的提取质量随着桑椹粉碎度的增加而增加，在粉碎达到120目时，多酚提取质量达到最大，因此最佳粉碎度为120目，如图2所示。

3.1.3料液比对多酚提取质量的影响称取过120目筛的桑椹粉末0.5g于50ml具塞三角瓶中，以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分别加入50%乙醇5、10、15、20、25ml，超声提取30min，提取温度60℃，4000r离心，取上清液，测多酚含量，结果桑椹多酚提取质量随着料液比的增大而增大，当料液比为1∶40时，多酚提取质量达到最大，因此最佳料液比为1∶40，如图3所示。

3.1.4超声提取时间对多酚提取质量的影响称取过120目筛的桑椹粉末0.25g，共6份于50ml具塞三角瓶中，各加入50%乙醇15ml，分别提取10、20、30、40、50、60、70min，提取温度60℃，4000r离心，去上清液，测多酚含量。结果多酚提取质量与提取时间无明显线性关系，提取时间为20min时，提取多酚质量最多，与30、50min提取时间相当，如图4所示。

根据单因素实验结果，可确定桑椹多酚提取的最佳单因素条件为：乙浓度40%，桑椹粉碎度为120目，料液比1∶40，超声时间20min。

3.2响应面试验与分析响应面分析方案与结果见表2.

3.2.1多元二次回归模型的建立利用Design-Expert8.5.0 软件对表2试验数据进行多元回归拟合，获得超声提取桑椹多酚质量（Y）对乙醇浓度（A）、桑椹粉碎度（B）、料液比（C）的二次多项回归模型方程为：Y=14.07-0.63A+1.67B+0.49C-0.77AB-1.29A2-0.59C2。

式中Y为多酚提取质量（mg），A为乙醇浓度（%），B为粉碎度（目），C为料液比（g/ml）。AB为乙醇浓度和粉碎度的交互项，A2为乙醇浓度的二次项，C2为料液比的二次项。

表2Box-Behnken设计响应面分析结果

实验号ABCY（mg）

1-1-1011.397

21-1010.885

3-11016.427

411012.825

5-10-111.535

610-111.715

7-10113.08

810111.963

90-1-111.668

1001-114.448

110-1112.33

1201115.9

1300014.337

1400013.34

1500014.24

1600013.945

1700014.04

表3Box-Behnken设计回归方程方差分析表

方差来源平方和自由度均方差F值P值显著性

总模型38.5966.4323.9<0.0001**

A3.1913.1911.850.0063**

B22.18122.1882.41<0.0001**

C1.9111.917.090.0238*

AB2.3912.398.870.0138*

A27.0717.0726.280.0004**

C21.4811.485.480.0412*

残差2.69100.27

失拟项2.0860.352.280.2227

纯误差0.6140.15

总变异41.2916

注：**P<0.01，*P<0.05。

利用Design-Expert8.0.61软件的ANOVA分析响应面的回归参数，回归方程中各自变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值中，P ≤0.01的项，对Y影响极为显著；P ≤0.05的项，对Y影响显著；P>0.05的项，对Y影响不显著，一般将该项剔除。模型项P ≤0.05说明Y与A、B、C回归方程的关系是显著的；P ≤0.01说明Y与A、B、C回归方程的关系是极显著的；P>0.05说明Y与A、B、C回方程的关系是不显著的。失拟项的P>0.05，说明方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，方程表示Y与A、B、C的关系好。

由表3可以看出，该回归方程模型的P<0.0001，说明该回归方程具有极显著性，试验设计可靠；失拟项P=0.2227>0.05，说明回归方程模型失拟不显著；乙醇浓度（A）一次相及其二次项、粉碎度（B）一次相的P<0.01具有极显著性。而料液比（C）一次相及其二次项，乙醇浓度和粉碎度的交互项的P<0.05，具有显著性。从分析结果可知，对Y值的影响大小顺序为：粉碎度（B）>乙醇浓度（A）>料液比（C）。

3.2.2效应面分析由3.2.1分析可知，只有AB交互项具有显著性，通过Design-ExPert8.0.61软件分析可以得出AB两个因素交互影响超声提取桑椹多酚的响应曲面和等高线图，直观的反映AB因素交互作用对响应值的影响，如图2所示，B因素为粉碎度，随着粉碎度的增加，响应面的平面最高，且达到最大值，而在A因素（乙醇浓度）的影响下，随着乙醇浓度的增大，响应值先增大后减小，则当粉碎度取实验最大值，乙醇浓度取实验中间值时，响应值（桑椹多酚提取质量）最大，如图5所示。

3.3验证试验以上述响应面优化条件，取乙醇浓度45%，桑椹粉碎度120目，料液比1∶34，进行超声提取桑椹多酚，进行三组平行实验，所得结果为桑椹多酚平均提取质量为16.18mg，与预测值16.43mg极为相近。

4结论

实验研究超声提取桑椹多酚的提取工艺条件，运用Design-Expert8.0.61软件的Box-Behnken响应面设计优化提取条件，优化结果表明，乙醇浓度、粉碎度对桑椹多酚提取质量的影响有极显著性，料液比对桑椹多酚提取质量的影响有显著性。最优提取条件为乙醇浓度A为44.6%、粉碎度为120目、料液比为1∶34，多酚提取质量达到最大，其预测值为16.43mg。以响应面的优化条件进行超声提取实验，桑椹多酚提取质量为16.18mg，与预测最高值极为相近，说明该回归方程模型有效，优化条件切实可行。响应面Box-Behnken设计可以用于有效成分的提取条件优化，通过回归方程的建立，得出确切的优化值，并通过实验的验证，有效提高有效成分的提取率，为桑椹多酚资源的利用奠定了实验基础。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：281.

[2] 李昊阳，夏继桥，杨连玉，等.植物多酚的抗氧化能力及其在动物生产中的应用[J].动物营养学报，2013，25（11）：1-6.

[3] 陈孝娟，顾政一，黄华，等.石榴皮总多酚抗菌消炎作用的初步研究[J].西北药学杂志，2011，26（4）：268-270.

[4] 王修杰，袁淑兰，魏于全.植物多酚的防癌抗癌作用[J].天然产物研究与开发，2005，17（4）：508-515.

[5] 梁晓东，潘国凤，吕圭源.超声提取在中药化学成分提取中的应用研究进展[J].时珍国医国药，2004，15（12）：861-862.

[6] 李巨秀，王柏玉.福林-酚比色法测定桑椹中总多酚[J].食品科学，2009，30（18）：292-295.

[7] 石碧，狄莹.植物多酚[M].北京：科学出版社，2000：4.

（收稿日期：2015.04.03）