雷帕霉素对S180肉瘤细胞及CD90、CD133、Notch1蛋白表达的影响

孔 萍，王康嵘，张 静

(1.宜昌市夷陵医院药剂科，宜昌 443100；2.武汉市普仁医院耳鼻喉口腔头颈外科，武汉 430081)

恶性肿瘤是目前导致居民死亡的主要原因之一[1]。近年研究发现，抗原分化簇90(CD90)参与肿瘤细胞增殖、转移、凋亡等过程，可在各种正常组织或细胞中表达并与肿瘤预后密切相关[2]。肿瘤干细胞(CSCs)的存在是肿瘤逆转和恢复的主要原因之一。抗原分化簇133(CD133)为CSCs标志物，Notch为调控CSCs的经典信号通路。研究表明，CD133和Notch1具有致瘤性，且与CSCs肿瘤的发生、转移和耐药有关[3-4]。研究证实，细胞自噬具有促进肿瘤细胞发生和发展的作用，通过抑制细胞自噬可达到抗肿瘤作用[5]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)为细胞自噬的重要调控途径。雷帕霉素是目前临床常用的mTOR受体抑制剂，可通过抑制mTOR活化，促进细胞自噬[6]。本研究观察了雷帕霉素对S180肉瘤细胞和小鼠S180肉瘤模型的抑瘤作用，以及对肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达的影响，旨在进一步探讨雷帕霉素的抗肿瘤作用机制，为临床抗肿瘤治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 Multiskan FC型酶标仪和Attune NxT型流式细胞仪，均购自美国赛默飞世尔公司。

1.2材料 小鼠S180肉瘤细胞，上海江林生物科技有限公司；雷帕霉素(批号822178)，北京华迈科生物技术有限责任公司；DMEM完全培养基(批号31600)、磷酸盐缓冲液(PBS，批号P1022)、胰蛋白酶(批号T1320)、CCK-8试剂盒(批号CA1210)、抗荧光衰减封片剂(批号S2100)、HRP标记二抗(批号SE064)、DAB显色试剂盒(批号DA1015)，均购自北京索莱宝科技有限公司；细胞周期检测试剂盒(批号340242)、细胞凋亡检测试剂盒(批号556507)，均购自美国BD公司；冷冻包埋剂(批号6506)、荧光二抗(批号A-11034)，均购自美国赛默飞世尔公司；CD90多克隆抗体(批号ABP56393)、CD133多克隆抗体(批号ABP52923)、Notch1多克隆抗体(批号PAB19810)、β-actin多克隆抗体(批号ABP50593)，购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.3动物 KM小鼠(批号CS-003)，雄性，40只，6～8周龄，体质量为(20.13±1.78) g，均购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号SCXK(辽)20200002。

2 方法

2.1体外实验

2.1.1细胞培养与分组 在液氮中取出冻存细胞，置于37 ℃水浴锅中融化，移至15 mL离心管中，加入预热的DMEM完全培养基10 mL，以2 000 r·min-1离心2 min，弃上清液；以DMEM完全培养基10 mL清洗，弃上清液；再次加入DMEM完全培养基10 mL，接种于培养板中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，待细胞融合度达80%～90%时，弃去培养基；以PBS清洗2次，加入胰蛋白酶3 mL消化，3 min后以DMEM完全培养基终止反应，移至15 mL离心管中，以2 000 r·min-1离心2 min，弃上清液；加入PBS 10 mL，吹匀后细胞以1×105个·孔-1接种于96孔板中，孵育过夜，雷帕霉素低、中、高剂量组分别加入20、50、100 nmol·L-1的雷帕霉素；对照组加入等量培养液，每组设置5个复孔；空白组仅加入等量培养液。

2.1.2细胞增殖 采用CCK-8法检测细胞增殖。雷帕霉素分别作用24、48、72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃避光孵育3 h；用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值A，实验重复3次，取平均值，细胞增殖抑制率(%)=[1-(A给药组-A对照组)÷(A对照组-A空白组)]×100%。

2.1.3细胞周期与凋亡 采用流式细胞术法检测细胞周期与凋亡。雷帕霉素作用48 h后，在4 ℃条件下，以3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液；加入预冷的PBS洗涤2次，以100 μL结合PBS重悬细胞；分别按照细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，实验重复3次，取平均值。

2.2体内实验

2.2.1模型构建与分组 将S180肉瘤细胞以1×106个·mL-1接种于小鼠左前肢腋下皮下，24 h后随机将小鼠分为对照组以及雷帕霉素低、中和高剂量组；定期测量小鼠体质量和肿瘤长径(a)、短径(b)，计算肿瘤体积V(mm3)，V=ab2÷2，当V≥100 mm3时，按照人体临床用量的0.5、1.0、2.0倍换算小鼠用量，雷帕霉素低、中和高剂量组小鼠分别以1、2、4 mg·kg-1雷帕霉素灌胃，对照组以等量生理盐水灌胃，每日1次，共3周。

2.2.2皮下成瘤实验 末次灌胃后24 h，测定小鼠体质量，以CO2吸入麻醉，剥取肿瘤称定质量，记录瘤质量并计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(对照组瘤质量-给药组瘤质量)÷对照组瘤质量×100%。

2.2.3肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达 取肿瘤组织，一部分保存于-70 ℃冰箱内，用于免疫荧光染色；另一部分固定于甲醛中，用于免疫组织化学染色。(1)免疫荧光染色：取组织，用冷冻包埋剂包埋后，用切片机制备成厚8 μm的连续切片；4 ℃下丙酮固定10～20 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加正常羊血清，37 ℃反应30 min；弃去多余血清，滴加一抗，4 ℃过夜；用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加荧光素标记二抗，37 ℃避光孵育60 min；PBS冲洗3次，每次5 min；以抗荧光衰减封片剂封片，400倍荧光显微镜观察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白阳性信号为细胞膜或细胞浆出现绿光颗粒、细胞核出现蓝光颗粒；计算染色强度，染色强度越大提示蛋白表达越强。(2)免疫组织化学染色：取组织，依次进行常规脱水、透明、浸蜡处理后，以石蜡包埋，用切片机制备成厚4 μm的连续切片；烤片60 min，依次进行脱蜡、水化，加入过氧化氢溶液灭活；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加抗原修复液，沸水浴中煮沸15 min，自然冷却至室温；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加HRP标记二抗，37 ℃孵育60 min；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加DAB显色剂，3 min后用自来水冲洗，苏木素复染3 min，分化液反应30 s，反蓝后用自来水冲洗；常规脱水、透明处理后，以中性树胶封片，400倍显微镜下观察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白阳性信号为细胞膜或细胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒，计算灰度值，灰度值越高提示蛋白表达越弱。

3 结果

3.1雷帕霉素对S180肉瘤细胞增殖的影响 见表1。由表1可知，与对照组比较，雷帕霉素低、中和高剂量组作用S180肉瘤细胞后，细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，且与作用时间呈正相关；同一作用时间，细胞增殖抑制率随雷帕霉素浓度的增加而升高(P<0.05)。

表1 不同浓度雷帕霉素对S180肉瘤细胞各时间点细胞增殖抑制率的影响

3.2雷帕霉素对S180肉瘤细胞周期的影响 见表2。由表2可知，与对照组比较，雷帕霉素低、中和高剂量组作用S180肉瘤细胞48 h后，细胞周期阻滞明显(P<0.05)，主要阻滞于G0/G1期。

表2 不同浓度雷帕霉素对S180肉瘤细胞各细胞周期抑制率的影响

3.3雷帕霉素对S180肉瘤细胞凋亡的影响 见图1和表3。由图1和表3可知，与对照组比较，雷帕霉素低、中和高剂量组作用S180肉瘤细胞48 h后，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，呈浓度依赖性。

图1 不同浓度雷帕霉素作用于S180肉瘤细胞的凋亡情况

表3 不同浓度雷帕霉素对S180肉瘤细胞凋亡率的影响

3.4雷帕霉素对S180肉瘤小鼠的抑瘤作用 见表4。由表4可知，实验前后，各组小鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组比较，雷帕霉素低、中和高剂量组小鼠瘤质量显著降低，抑瘤率显著升高(P<0.05)；瘤质量随雷帕霉素浓度的增加而降低，抑瘤率随雷帕霉素浓度的增加而升高(P<0.05)。

表4 各组小鼠体质量、瘤质量和抑瘤率比较

3.5雷帕霉素对小鼠肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达的影响

3.5.1免疫荧光染色 见表5。由表5可知，与对照组比较，其他3组小鼠肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达显著降低，随雷帕霉素浓度增加而降低(P<0.05)。

表5 各组小鼠肉瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白免疫荧光染色结果比较

3.5.2免疫组织化学染色 见表6。由表6可知，与对照组比较，其他3组小鼠肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达显著降低，随雷帕霉素浓度增加而降低(P<0.01)。见表6。

表6 各组小鼠肉瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白免疫组化染色结果比较

4 讨论

恶性肿瘤是严重威胁居民生命健康的公共卫生问题，其发生和发展与细胞自噬密切相关[7]。吴晓莉等[8]研究表明，自噬活性改变可导致正常细胞恶性转化或促进肿瘤进展。mTOR为诱导细胞自噬和抑制肿瘤细胞增殖的重要途径[9]。雷帕霉素为新型大环内酯类免疫抑制剂，主治器官移植术后抗排斥反应及自身免疫性疾病[10]。近年研究发现，雷帕霉素可与细胞内受体FKBP-12结合形成复合物，抑制mTOR活性和诱导细胞循环停滞在G1期[11]。宋魏等[12]研究发现，雷帕霉素可通过下调mTOR表达和mTOR磷酸化，降低mTOR信号通路活性，显著抑制鼻咽癌肿瘤干细胞增殖，达到抗肿瘤作用。

肉瘤源于小鼠间叶组织恶性肿瘤，常见于纤维肉瘤、骨肉瘤、淋巴肉瘤等[13]。崔明星等[14]以不同浓度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用于人骨肉瘤MG-63细胞发现，作用3～5 d后细胞增殖能力显著降低。另有研究发现，通过调控磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR信号通路，可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移[15]。本研究使用的小鼠S180肉瘤细胞来源于白人女性骨肉瘤组织，不同浓度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用后发现，S180肉瘤细胞增殖抑制率显著升高，且与作用时间呈正相关，符合以往研究结果[16]，同一作用时间，细胞增殖抑制率随雷帕霉素浓度的增加而升高，提示随着雷帕霉素浓度的增加，其抑制肿瘤细胞增殖能力可能越强。既往研究结果显示，雷帕霉素可抑制高糖状态下肾系膜细胞增殖，促进其凋亡并使细胞阻滞于G1/S期[17]。周伦欢等[18]研究发现，雷帕霉素可通过抑制mTOR通路活性，将细胞阻滞于G1/G0期，抑制伯基特淋巴瘤细胞株增殖和诱导细胞凋亡。本研究结果显示，雷帕霉素作用S180肉瘤细胞48 h后，细胞周期阻滞明显，且主要阻滞于G0/G1期，雷帕霉素促进细胞凋亡作用呈浓度依赖性，符合以往研究结果。以上体外实验证实，雷帕霉素具有明显的抗肿瘤作用，可能通过抑制细胞增殖，阻滞细胞周期于G1/G0期，促进细胞凋亡实现。Shen M H等[19]研究发现，雷帕霉素能显著降低肿瘤负荷。本研究通过构建小鼠S180肉瘤皮下荷瘤模型发现，雷帕霉素可显著降低小鼠瘤质量，且瘤质量随雷帕霉素浓度的增加而降低，抑瘤率随雷帕霉素浓度的增加而升高，符合以往研究结果，体内实验进一步证实雷帕霉素具有明显的抗肿瘤作用。CSCs是影响肿瘤形成、增殖、复发和转移的重要因素。Hubo Shi等[20]研究发现，雷帕霉素诱导的肿瘤生长延迟可能与抑制肿瘤干细胞表型Notch1、CD133和CD90蛋白表达有关。本研究分别采用免疫荧光染色和免疫组织化学染色法检测肿瘤组织Notch1、CD133和CD90表达，结果均显示，雷帕霉素可显著抑制小鼠肿瘤组织CD90、CD133和Notch1蛋白表达，且随雷帕霉素浓度的增加而降低，符合以往研究结果。

综上所述，雷帕霉素可能通过下调CD90、CD133和Notch1蛋白表达，影响S180肉瘤细胞的增殖和凋亡，达到体内外抑瘤作用。