lncRNA AL158206.1/miR-340-5p/ARL4C轴对食管癌增殖和迁移的调控作用

吴 菁 蒋志勇 李奎生 刘 芳 吕志武 * 黄明沂 肖 瑶

（1 深圳市宝安区福永人民医院消化内科，广东 深圳 518103；2 武汉大学中南医院影像科，湖北 武汉 430071；3 南方医科大学附属深圳宝安医院消化内科，广东 深圳 518101）

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来食管癌的诊断和治疗得到不断发展，但患者预后并不理想，中晚期食管癌患者的5年生存率低于20%[1-2]。食管癌发生、发展过程伴随多种分子及信号通路的协同作用[3]。长链非编码RNA（longchain non-coding RNA，lncRNA）是一种转录长度超过200个核苷酸的内源性RNA分子，通过调控基因表达影响细胞增殖、炎性反应、细胞凋亡、细胞外基质降解等病理过程[4-5]。有研究表明，lncRNA在食管癌、鼻咽癌、淋巴癌等多种肿瘤的发生和进展过程中起重要作用[6-7]。本研究旨在研究AL158206.1在食管癌细胞系中的表达，观察上调AL158206.1对食管癌细胞增殖及迁移的影响，探讨AL158206.1是否通过调控miR-340-5p/ARL4C轴发挥其作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 人食管上皮细胞（HET-1A）和食管癌细胞系（Eca109、KYSE30、TE-13、EC9706）购自中国科学院上海细胞库。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司。NC质粒和AL158206.1质粒购自北京合生基因科技有限公司。RPMI1640培养基购自美国HyClone公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。Transwell小室购自美国康宁公司。Lipofectamine 3000试剂购自美国Sigma公司。MTT试剂盒购自南京诺唯赞生物科技公司。一抗和二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及转染 食管癌细胞系和食管上皮细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，培养条件是37 ℃、5%CO2、饱和湿度。将对数生长期KYSE30细胞接种至6孔板，细胞贴壁生长后，严格按照Lipofectamine 3000试剂说明书进行转染操作，分别转染AL158206.1质粒（AL158206.1组）和NC质粒（NC组），转染12 h后更换培养基培养。

1.3 qRT-PCR检测AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA表达水平TRIzol试剂提取食管癌细胞系和人食管上皮细胞系总RNA，逆转录合成cDNA后在PCR仪进行扩增，对AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA表达水平进行定量分析，U6和GAPDH分别为内参。相应引物序列如下，U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-340-5p上游引物为5'-GCTTATAAAGCAATGAGACTGATT-3'，下游引物为5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；GAPDH上游引物为5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游引物为5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'；AL158206.1上游引物为5'-TGGTCAGAATTTGCCCAAG-3'，下游引物为5'-TGAAATGATCACTCGGAAACA-3'；ARL4C上游引物为5-CCAGTCCCTGCATATCGTCAT-3'，下游引物为5'-TTCACGAACTCGTTGAACTTGA-3'。采用2-ΔΔCt方法计算AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA的相对表达量。

1.4 MTT法测定细胞增殖能力 将成功转染的AL158206.1组和NC组KYSE30细胞经胰酶消化为游离细胞，重新接种于96孔板，在培养箱中培养。使用MTT试剂盒连续5 d检测细胞的增殖水平，每孔加入20 μL MTT试剂，培养箱培养2 h后弃上清，每孔加入130 µL二甲基亚砜，摇床振荡10 min，酶标仪测量波长450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

1.5 Transwell试验测定细胞迁移能力将成功转染的AL158206.1组和NC组KYSE30细胞经胰酶消化为游离细胞，采用无胎牛血清的RPMI1640培养基重悬后接种于Transwell上室，将含胎牛血清的RPMI1640培养基加入下室，培养箱培养24 h后，将Transwell上室放入甲醇中固定40 min，放入结晶紫溶液中染色40 min，棉签擦拭Transwell上室上侧，放入倒置显微镜拍照并计数。

1.6 生物信息学预测AL158206.1的靶基因 采用LncBase Predicted v.2数据库预测AL158206.1的靶向miRNA，采用miRWalk 2.0数据库预测miRNA的靶向基因。

1.7 Western blot试验检测ARL4C蛋白表达 提取各组KYSE30细胞，加入含1%苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，冰上裂解40 min，采用BCA法检测各组KYSE30细胞的蛋白含量，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶在室温下进行封闭，加入一抗ARL4C（1∶1 000稀释）、CDK2（1∶1 000稀释）、Cyclin E（1∶3 000稀释）、IRSp53（1∶2 000）、β-Tubulin（1∶3 000）及MMP-1（1∶1 000），在4 ℃孵育过夜。使用羊抗兔的二抗（1∶2 000稀释）孵育50 min。使用ECL发光试剂进行化学发光检测，以β-Tubulin为内参。

1.8 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料均采用均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AL158206.1在食管癌细胞系中的表达 qRT-PCR试验结果显示，与人食管上皮细胞相比，AL158206.1在食管癌细胞系（Eca109、KYSE30、TE-13、EC9706）中的表达明显减少（P＜0.05），KYSE30细胞中的表达最低（P＜0.01）。见图1。

图1 AL158206.1在人食管上皮细胞和食管癌细胞系中的表达

2.2 转染质粒对KYSE30细胞中AL158206.1表达的影响 qRTPCR试验结果显示，NC组和AL158206.1组KYSE30细胞中AL158206.1表达水平分别为（1.04±0.15）和（12.56±0.93）。与NC组相比，AL158206.1组KYSE30细胞中AL158206.1的表达明显增加（P＜0.01）。

2.3 上调AL158206.1对KYSE30细胞增殖能力的影响 MTT试验结果显示，第2、3、4、5天，上调AL158206.1后，KYSE30细胞增殖能力明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 上调AL158206.1对KYSE30细胞增殖能力的影响

2.4 上调AL158206.1对KYSE30细胞迁移能力的影响 Transwell试验结果显示，NC组和AL158206.1组KYSE30细胞的迁移数分别为（170.60±22.74）个和（77.84±12.64）个，AL158206.1组细胞的迁移数明显低于NC组（P＜0.05），表明上调AL158206.1可抑制KYSE30细胞的迁移能力。见图3。

图3 上调AL158206.1对KYSE30细胞迁移能力的影响

2.5 生物信息学预测AL158206.1的靶基因AACAGAAAUAAAUUAUUUAUAC 采用LncBase Predicted v.2数据库预测显示，AL158206.1的靶基因是miR-340-5p；采用miRWalk 2.0数据库预测显示，miR-340-5p的靶基因是ARL4C。见图4。

图4 生物信息学预测AL158206.1的靶基因

2.6 上调AL158206.1对KYSE30细胞中miR-340-5p和ARL4C mRNA表达水平的影响 qRT-PCR试验结果显示，NC组和AL158206.1组KYSE30细胞中miR-340-5p表达水平分别为（1.19±0.23）和（0.13±0.06），AL158206.1组miR-340-5p的表达明显低于NC组（P＜0.01）。NC组和AL158206.1组KYSE30细胞中ARL4C mRNA表达水平分别为（1.01±0.09）和（7.23±0.78），AL158206.1组ARL4C mRNA的表达明显高于NC组（P＜0.01），表明上调AL158206.1可抑制miR-340-5p的表达，促进ARL4C mRNA的表达。

2.7 上调AL158206.1对ARL4C蛋白和增殖及迁移有关蛋白表达的影响 Western blotting试验结果显示，上调AL158206.1后，ARL4C蛋白表达水平增加，细胞增殖有关蛋白如CDK2、Cyclin E表达水平减少，细胞迁移有关蛋白如IRSp53、MMP-1表达水平减少。见图5。

图5 上调AL158206.1对KYSE30细胞ARL4C和增殖及迁移有关蛋白表达的影响

3 讨论

lncRNA虽然不具有蛋白质编码的功能，但其可在基因染色质修饰、转录激活、转录干扰等过程中发挥作用[8-9]。在包括肿瘤在内的各种疾病中均存在lncRNA的异常表达，lncRNA可直接或间接参与调控各种信号通路的转导，作为癌基因或抑癌基因影响肿瘤的发生和发展[10-11]。Fang等[12]研究表明，LINC01535在食管癌组织和细胞中表达明显高于癌旁组织和食管黏膜上皮细胞，敲除LINC01535会通过调节JAK/STAT3信号通路降低食管癌细胞增殖能力，增加细胞的凋亡率。Qiu等[13]研究显示，PSMA3-AS1在食管癌组织中表达显著上调，PSMA3-AS1表达与食管癌患者肿瘤大小、远处转移和不良预后相关，PSMA3-AS1过表达促进食管癌细胞的增殖、侵袭和体外迁移。AL158206.1在肿瘤特别是食管癌细胞中的表达和作用尚不清楚。本研究中，AL158206.1的表达在食管癌细胞系中明显增加，提示AL158206.1参与了食管癌发生发展过程。在食管癌KYSE30细胞中上调AL158206.1后，KYSE30细胞的增殖及迁移能力明显降低，AL158206.1在食管癌中发挥抑癌基因功能。

lncRNA可通过应答元件竞争性结合具有相同应答元件的miRNA，从而抑制miRNA对靶基因的干扰作用，间接促进miRNA靶基因的表达[14-15]。本研究中生物信息学预测显示，AL158206.1可靶向miR-340-5p，miR-340-5p可靶向ADP-核糖基化样因子4C（ARL4C）mRNA。有研究显示，miR-340-5p在食管癌组织中高表达，降低食管癌细胞的放疗敏感性，发挥致癌基因功能[16]。本研究中，上调AL158206.1后，miR-340-5p的表达明显减少。ARL4C蛋白由192个氨基酸组成，属于ADP-核糖基化样因子亚家族成员，参与细胞内的囊泡运输[17]。ARL4C可通过调控肌动蛋白细胞的骨架重构，影响上皮细胞和迁移[18]。上调ARL4C可抑制卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移或侵袭，且ARL4C表达水平较低的肿瘤患者预后较差[19-20]。qRT-PCR和Western blot试验结果显示，AL158206.1抑制miR-340-5p表达后，miR-340-5p靶基因ARL4C的表达明显增强。本研究中，KYSE30细胞中ARL4C蛋白表达增强后，细胞增殖有关蛋白如CDK2、Cyclin E表达水平减少，细胞迁移有关蛋白如IRSp53、MMP-1表达水平减少，表明KYSE30细胞的增殖及迁移能力降低。

综上所述，AL158206.1在食管癌细胞系中低表达，上调AL158206.1可能是通过调控miR-340-5p/ARL4C轴的表达，抑制食管癌细胞的增殖和迁移能力。AL158206.1可能为食管癌的生物靶向治疗提供新的候选靶点。